lando双层人工真皮修复材料与自体刃厚皮片移植对创面细胞因子的影响

苑莎莎 范炜 王香坤 焦建强 梁清国 李烨

真皮的重建和再生，在皮肤缺损患者的皮肤修复中具有至关重要的意义，其关系创面愈合的质量，可以保证永久性创面覆盖[1]。传统的自体皮片移植治疗可以避免免疫排斥，取得很好的治疗效果[2]，但是容易遗留供皮区瘢痕，而且对于大面积烧伤以及幼儿等特殊患者的治疗有很大困难。真皮替代物的出现是解决这一问题的关键。自Integra LifeSciences公司在20世纪80年代开发的Integra以来[3]，人工真皮在短短的几十年时间里得到了迅速的发展。Integra的真皮替代部分是由牛肌腱中提取的Ⅰ型胶原与6-硫酸软骨素交联形成的，表皮替代物是硅胶膜。人工真皮的诞生对于减少供区损伤，改善新生组织外观具有重要意义[4,5]。以往人工修复材料均为进口，常见的有日本进口的Pelnac等[6,7]。2017年8月深圳兰度生物材料有限公司生产的Lando双层人工真皮修复材料获CFDA批准上市，属国内首家。Lando双层人工真皮修复材料下层为牛跟腱Ⅰ型胶原与硫酸软骨素交联制成的仿真皮部分，上层是半透膜性质的医用硅橡胶层。以往研究表明，其具有很好的皮肤创面修复功能[8,9]。但目前临床研究主要集中在以动物为研究对象，针对人体的相关研究仍然较少，临床数据不完善，缺乏更加有力和全面的数据支持。本研究讨论lando双层人工真皮修复材料与自体刃厚皮片联合移植对创面细胞因子的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究采用前瞻性研究方法。选择我院2016年6月至2019年3月收治的关键功能部位深度烧伤患者57例(包括烧伤部位共82处)。其中男34例，女23例；年龄3～57岁，平均(21.4±4.6)岁；伤后24～120 h，平均(56.4±15.2)h；热液烫伤30例，火焰烧伤14例，电烧伤13例；创面为深Ⅱ度～Ⅲ度，面积4%～22%；烫伤后形成瘢痕挛缩15例。植皮部位：手背部和腕部19处，肘窝18处，肘关节外侧10处，腋窝6处，颈部7处，膝关节16处(腘窝12处)，踝部6处。供皮部位：大腿35例，背部6例，侧胸部16例。将患者按照随机数字表法分为联合组(37例)和自体组(20例)，2组在性别比、年龄、原因、部位、受伤时间、严重分度、面积等方面差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准。见表1。

表1 2组患者一般情况比较

1.2 治疗方法

1.2.1 创面处理:手术区域0.5%碘伏消毒铺巾，彻底去除坏死组织，深Ⅱ度创面削痂扩创至真皮深层，Ⅲ度创面扩创至深筋膜浅层，用双极电凝彻底止血后，分别用3% H2O2溶液、0.1碘伏溶液、0.9%氯化钠溶液依次冲洗创面2～3次。

1.2.2 联合组的皮肤移植:①根据创面大小选用合适规格的lando双层人工真皮修复材料，用无菌0.9%氯化钠溶液冲洗3～5次后备用。将准备好的Lando双层人工真皮修复材料平铺于等待植皮的创面上，用4-0丝线缝合固定皮片边缘。植皮区域依次用纳米银敷料、无菌碘伏纱布、无菌棉垫覆盖，颈部植皮区域打包加压固定，腋窝处创面打包加压固定后外用石膏固定，其余部位植皮区域绷带包扎固定后石膏固定。术后3 d 换药1次，观察真皮下有无瘀血，如无瘀血纳米银纱布包扎，如有瘀血给予清除后包扎。2周后去除双层真皮外层硅胶膜，下面肉芽组织已形成，再次手术治疗。②术中同前消毒，以手术刀轻刮肉芽创面至新鲜出血，再次同前冲洗创面，用电动皮刀在供皮区取大块刃厚皮(厚度大约为0.25 mm)放入0.9%氯化钠溶液中清洗3～5次备用，供皮区创面用庆大霉素盐水纱布压迫止血后立即外涂医用生长因子凝胶，用纳米银敷料、无菌纱布包扎。将准备好的刃厚皮平铺于等待植皮的创面上，用4-0丝线缝合固定皮片边缘。植皮区域依次用纳米银敷料、无菌碘伏纱布、无菌棉垫覆盖加压包扎。1周后打开敷料，碘伏消毒后拆除缝线。

1.2.3 自体组皮片的移植:消毒，依创面情况用电动皮刀在供皮区切取皮肤的部分厚度或全层厚皮片，移植于创面。植皮区域依次用纳米银敷料、无菌碘伏纱布、无菌棉垫覆盖加压包扎。1周后打开敷料，碘伏消毒后拆除缝线。

1.3 观察指标 随访观察植皮区域皮肤颜色、外观、质地，与正常皮肤连接处的瘢痕增生情况，关节功能情况。于治疗3、7、14 d取创面基底部组织，测定IFN-γ、TNF-α、IL-1、IL-12、VEGF、TGF-β1、P53、Bax、Caspase-3水平。将所取组织充分研碎，加入EGF中并充分匀浆，经4℃ 3 000 r/min离心，选取上清液，采用酶联免疫吸附法测定。

2 结果

2.1 愈合情况 本研究患者共49例72处关键功能部位皮片均成活愈合好，皮片光滑柔软，弹性好，其中联合组35例50处，自体组14例22处。联合组2例3个部位，自体组4例6个部位皮片边缘有散在点状坏死，经换药治疗后7～14 d愈合。自体组1例1处移植皮片未成活，经二次移植成活。2组治疗效果差异有统计学意义(Fisher精确检验P=0.001)。

2.2 瘢痕形成及关节功能情况 治疗后随访6～18(12.2±1.4)个月，联合组植皮区一期愈合皮片无明显增生挛缩的瘢痕，关节功能恢复接近正常水平，有轻微色素沉着；延迟愈合皮片有少许增生瘢痕，色泽外观略差于正常愈合处皮肤，关节功能恢复相差不大。联合组供皮区无明显瘢痕，色泽接近正常皮肤。自体组8例供皮区出现较明显瘢痕，2例4处植皮区有较明显瘢痕生成。

2.3 创面细胞因子情况

2.3.1 创面炎性因子情况:术后2组创面中炎性因子IFN-γ、TNF-α、IL-1、IL-12水平均逐渐下降，组间比较，术后3、7、14 d同一时间指标差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

项目3 d7 d14 dTNF-α 联合组(n=37)3.52±0.382.76±0.322.34±0.33 自体组(n=20)3.47±0.402.69±0.352.38±0.30IFN-γ 联合组(n=37)5.46±0.554.36±0.482.63±0.48 自体组(n=20)5.56±0.524.23±0.502.76±0.44IL-1 联合组(n=37)6.92±0.784.49±0.663.89±0.53 自体组(n=20)6.54±0.834.85±0.573.75±0.58IL-12 联合组(n=37)0.55±0.040.49±0.060.28±0.03 自体组(n=20)0.53±0.050.46±0.060.26±0.04

2.3.2 创面生长细胞因子情况:2组术后创面中生长细胞因子VEGF、TGF-β1呈逐渐升高趋势，组间比较，术后3 d差异无统计学意义(P>0.05)，但术后7、14 d组间差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

项目3 d7 d14 dVEGF 联合组(n=37)45.37±6.4858.46±10.25∗80.53±12.41∗ 自体组(n=20)46.84±7.2266.26±10.3192.45±13.87TGF-β1 联合组(n=37)20.36±6.2727.64±6.42∗36.97±8.52∗ 自体组(n=20)22.41±6.4835.25±6.6945.75±8.23

注：与自体组比较,*P<0.05

2.3.3 创面凋亡基因表达情况:2组术后创面中P53、Bax、Caspase-3呈逐渐下降趋势，组间比较，术后3、7、14 d同一时间指标组间差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4。

项目3 d7 d14 dP53(pg/ml) 联合组(n=37)736.61±31.75492.42±25.28383.26±19.41 自体组(n=20)745.95±28.42503.67±24.85386.43±17.47Bax(ng/ml) 联合组(n=37)52.25±6.3725.45±3.2020.64±2.63 自体组(n=20)54.16±6.4226.96±3.2421.26±2.54Caspase-3(ng/ml) 联合组(n=37)24.78±2.7216.93±2.3311.36±1.64 自体组(n=20)22.85±2.6518.52±2.2312.53±1.77

3 讨论

车祸、烧伤、难愈性溃疡等是造成临床皮肤损伤的常见原因，主要而有效的治疗方法是皮肤移植、皮瓣组织扩张器等，治疗效果理想。但是自体皮肤移植尤其是大面积移植，可能影响供皮区外观，甚至功能。对于大面积皮肤创伤和对外形要求较高的群体，手术较难开展。并且由于存在一次手术无法使创面完全愈合的情况，可能增加手术次数，增加患者痛苦。人工真皮替代材料的出现改善了这种情况。人工真皮是一种由牛跟腱胶原与硫酸软骨素交联构成的类真皮支架网状结构[10]，可以诱导成纤维细胞形成分布合理的新生胶原，促使毛细血管芽长入其中，从而提高再次移植的薄的断层皮片的成活率，减少手术次数。并且移植后的皮片具备中厚植皮的特性，具有很强的弹性和耐磨抗压性。动物及临床实验研究均证明，人工真皮可以帮助修复皮肤缺损，且有助于减少瘢痕的产生[11]。Lando人工真皮材料是由我国制造的，目前临床相关研究较少，针对局部微观变化的研究笔者尚未见报道。

皮肤创面修复中一个重要的病理变化是炎性反应，一定程度的炎性反应有助于加速创面的愈合[12]。巨噬细胞是在炎性反应过程中介导吞噬和抗原提呈的细胞类型[13]。IFN-γ、TNF-α等细胞因子可以诱导M1型巨噬细胞产生IL-1、IL-12等促炎因子，调节TH1细胞活性和TC细胞活性，介导炎症级联反应[14,15]，从而参与创面病原微生物的杀伤，促进创口愈合。本研究测定了2组患者在治疗3 d、7 d、14 d时的炎性因子水平，总体均呈下降趋势，但2组差异不显著。这说明，人工真皮材料诱发创面炎性反应的能力与自体皮相当或创面炎性反应在人工真皮材料和自体皮肤移植的情况下水平相当，这与王桂芳等[9]的研究相符。可以推断人工材料和机体相容性较高，诱发机体的免疫反应水平低，不容易产生炎性反应和免疫排斥。

VEGF和TGF-β1是促进创面愈合过程中成纤维细胞和上皮细胞增殖的因子[16，17]。VEGF可以促进血管内皮生长，促进生成新血管，并且通过对基质金属蛋白酶表达的诱导改变细胞外基质，促进新生血管的生长。还具有促进内皮细胞增殖、移行的作用[18]。TGF-β1参与细胞增殖、分化，可以促进成纤维细胞增殖、增加创面胶原合成。但是两者的过度表达，容易在创面愈合时形成瘢痕[19-21]。本研究中，自体组VEGF和TGF-β1表达显著高于联合组，可能是自体组瘢痕形成较多的原因。

创面修复的过程不仅与促生长因子的作用有关，修复所需内皮细胞、上皮细胞和成纤维细胞的增殖还受凋亡分子的调控[22]。细胞内调节凋亡的两种机制为死亡受体凋亡途径和线粒体凋亡途径。线粒体凋亡途径通过Bax来启动下游Caspase所介导的级联激活反应，Caspase-3是此级联反应的最终激活因子，从而执行细胞凋亡。P53是体内多条凋亡途径的调控分子,能够通过阻碍细胞周期来抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡。对凋亡分子的分析证实，人工真皮对术后创面恢复过程中细胞凋亡表达的影响与自体皮比较没有明显差异，两者促进创面的愈合的作用无明显差异。

此外，联合组愈合情况较自体组好，瘢痕形成较少。联合组瘢痕形成较少，此结果与本研究中2组VEGF和TGF-β1水平的差异相符，低水平的促生长因子使得人工真皮材料组患者在修复过程中产生了更少的瘢痕，表面更加平整美观。这一点使其容易被广大患者接受，也更加适合对美容有特殊要求的群体，同时为其在美容行业的应用提供了基础。

本研究中，Lando人工真皮植入2周时，新生毛细血管充分长入，真皮支架充分形成，具备移植自体刃厚皮片的条件，且移植效果良好，该结果与刘洋等[23]结果接近，有关动物实验也显示了同样的研究结果。有研究发现人工真皮移植后第2天Fb即可侵入，并开始出现少量的中性粒细胞、淋巴细胞及巨噬细胞[24]。

人工真皮具有许多优点，其在合并骨、肌腱外露创面的修复也有良好的治疗效果，是较理想的真皮替代品，但是仍然存在一些问题：价格较高，部分患者会出于经济考虑，放弃使用；治疗过程较为复杂，要经过两次手术，给患者带来痛苦和心理负担。生物材料缺乏抗感染能力，术后护理极为重要，要严密观察，防止积液[25]，勤换药，防止感染。

移植过程中，清创的彻底和创面的平整很重要，关系到术后皮片的存活状态和是否感染。皮片的缝合注意保持一定的张力，但不能张力过大，有利于皮片成活、创面恢复且术后外观较好。人工真皮的仿真皮交联结构在过大的压力下有可能造成支架坍塌[26]，修复效果不理想，移植后加压包扎应注意压力适当。

本研究在微观水平探讨了应用人工修复材料创面的炎症水平、再生因子及凋亡因子的表达情况，客观评价了治疗后的恢复情况。但研究存在以下问题：(1)纳入人数较少，对于后期康复效果的比较难以以统计结果呈现，并且极易出现严重偏差，且小样本的研究会造成一些结果难以呈现或被忽略。还有待临床大样本、多中心的研究进一步验证。(2)对康复效果的评价多是肉眼观察的结果，缺乏标准，难以在重复实验中取得同样结果。如能实现将瘢痕、色泽、点状坏死等结果进行定量，则结果参考价值更高。(3)本研究对于不同的部位没有进行分类探讨，对严重的Ⅲ度烧伤，如肌肉缺失严重和骨裸露面积较大的烧伤，以及对手指关节处等对功能要求较高的，瘢痕和挛缩对预后影响较大的部位没有针对性的研究。

综上所述，国产Lando人工真皮在治疗皮肤缺损创面的作用确切，具有促进创面愈合，减少瘢痕形成的作用，是理想的替代材料。