2017年上海市活禽市场H9N2亚型禽流感病毒全基因进化分析

葛 杰，葛菲菲，吴 杰，周锦萍

（1.上海市动物疫病预防控制中心，上海201103；2.扬州大学生物科学与技术学院，扬州 225009）

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）为正黏病毒科A型流感病毒属成员。H9N2亚型禽流感病毒最早于1966年分离自北美火鸡，我国最早于1994年分离自广东省鸡群。1998-2000年在我国家禽中出现H9N2第一次大流行，以BJ/94亚群为主，随着H9N2疫苗的推广使用疫情得以控制。2008年出现第二次大流行，此时H9N2亚型以Y280亚群为主。目前H9N2在国内的检出率居高不下，多为隐性感染[1]。近年来研究显示，H9N2 AIV为H7N9、H10N8 AIV的重组演化提供内部基因，对病毒的变异和跨种间传播起到了重要作用[2-3]。HA蛋白作为流感病毒表面最重要的糖蛋白，是流感病毒的主要保护抗原，可以诱导机体产生中和抗体。2007年之后，我国H9亚型AIV以第h9.4.2.5分支为主，或者说是以A/Chicken/Guangxi/55/2005类的病毒为主[4]。H9N2亚型AIV通常表现为低致病性，很少导致家禽的直接死亡[5]，但其能够在全球范围的野鸟及家禽中持续流行，并在最近几年出现了很多人感染H9N2亚型AIV的病例。许多研究表明H9N2 AIV可能是其它亚型AIV内部基因的供体，比如1997年禽流感感染人事件的H5N1亚型AIV的内部基因就来自H9N2亚型AIV[6]。2013年在中国安徽省和上海市发现感染人的H7N9亚型AIV，其所有内部基因均属于H9N2亚型AIV分支[7]。本研究对2017年从上海活禽市场分离的6株AIV的8个基因片段进行序列测定和遗传规律分析，为H9N2 AIV的防控提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 病毒株 6株H9N2亚型AIV毒株由上海市动物疫病预防控制中心分离保存，分别命名为A/Chicken/Shanghai/1106-58/2017、A/Chicken/Shanghai/1106-65/2017、A/Chicken/Shanghai/1127-30/2017、A/Chicken/Shanghai/1127-35/2017、A/Chicken/Shanghai/0710-9/2017和A/Chicken/Shanghai/0710-10/2017。

1.2 实验动物及主要试剂 SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。H9荧光RT-PCR试剂盒购自深圳匹基生物工程有限公司提供。新城疫阳性血清、禽流感血凝素分型血清（H5、H9）由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供；AMV反转录酶等试剂均购自宝生物（大连）工程公司；特异引物由宝生物（大连）工程公司合成。

1.3 8个基因的扩增及序列分析 按照参考文献[4]的方法进行8个基因RT-PCR扩增、克隆和测序，其中序列测定由上海桑尼生物科技有限公司完成。参考GenBank中相关病毒株，利用Mega 6.0软件绘制HA基因的遗传系统进化树。

2 结果

2.1 HA基因同源性比较 通过RT-PCR扩增、克隆及序列测定获得了6株H9N2亚型AIV的HA、NA、M、NS、NP PA、PB1、PB2基因的序列，并将所有序列（48个序列）上传至GenBank中，获得的登录号为MG984005～984052。6株H9N2亚型AIV的HA基因全长均为1683个核苷酸，编码560个氨基酸。分离株与参考株BJ94核苷酸同源性为88.2%～99.9%，氨基酸序列同源性为89.9%～99.5%；而分离株之间核苷酸同源性为93.4%～99.9%，氨基酸序列同源性为93.8%～99.5%。

2.2 HA基因关键位点分析 A/Chicken/Shanghai/1106-58/2017和A/Chicken/Shanghai/1106-65/2017这2株病毒的受体结合位点右缘（146～150位氨基酸）为GTSKA，其余4株均为GTSTA；6株分离株HA唾液酸受体结合位点处氨基酸在191位为N（天冬酰胺），与经典的AIV国内分离株一致[8]。分离株A/CK/Shanghai/1106-58/2017、A/CK/Shanghai/1106-65/2017、A/CK/Shanghai/0710-10/2017在198位氨基酸aa分别变异为V（缬氨酸）、A（丙氨酸）、K（赖氨酸），其余毒株均为T（苏氨酸）。A/CK/Shanghai/1106-58/2017在202位氨基酸为P（脯氨酸），其余毒株均为L（亮氨酸）。本研究中的毒株在受体结合位点的左缘（232～237位氨基酸）均为NGLMGR，这6株病毒株均有潜在8个糖基化位点，HA裂解位点均为RSSR↓GLF，为弱毒序列，此外，这6株毒株在HA基因226位点均为Leu，表明有向人类感染的嗜性[9-10]（表1）。

2.3 HA基因遗传进化分析 利用Mega6.0软件对分离病毒株和参考病毒株HA基因的遗传进化关系进行分析，绘制遗传进化树（图1）。结果显示，所有分离株均为h9.4.2.5。

表1 6株H9N2分离毒株与参考株HA基因序列关键位点的比较Table 1 Comparison of several key sites of H9N2 subtype Avian influenza virus isolates

2.4 6株分离株的8个基因片段的重组模式 根据参考文献[11]，我们选择了1株G57基因型的毒株A/Chicken/Zhejiang/HJ/2007和本研究中的6个毒株进行基因进化分析（表2），结果显示，6株分离株与A/Chicken/Zhejiang/HJ/2007重组模式完全相同，均为四重重组体，由Y280亚系、Unknown、G1以及F98重组而成。

3 讨论

目前，能够造成人类感染的禽流感病毒亚型越来越多。2013年11月和2015年9月，湖南省分别报告1例人感染H9N2亚型禽流感病毒实验室诊断病例[12-13]。2017年，我们从上海活禽市场的鸡群中分离到6株H9N2禽流感病毒。通过HA基因分析，构成受体结合位点的氨基酸分别在109、161、163、191、198、202、203位，除198和202位氨基酸变化较大外，其它位点在所有毒株中都是相当保守的。1997年以前，中国流行的H9N2亚型AIV以CK/BJ/1/94基因型为主。目前国内流行的H9N2亚型AIV的HA、NA虽然以CK/Bei-like分支基因型为主，但其内部基因经常被其它分支的基因片段所取代，出现越来越多的重组基因型。Juan等[11]研究表明，G57基因型在2007年出现，其流行率在2009年剧增，并自2010年后在中国占主导地位。本研究分离的6株H9N2亚型AIV均属于G57基因型，表明上海地区2017年H9N2亚型AIV还是以G57基因型流行为主。综上所述，目前上海市活禽市场H9N2亚型AIV虽然以G57基因型为主，但其受体位点等呈现多样化，同时其内部基因为其它亚型AIV 提供内部片段，加大了对人类健康的威胁，所以应该对其监测防控工作给予重视，有效防止疫情的发生。

图1 6株H9N2亚型禽流感病毒HA基因遗传系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree of HA genes of the six H9N2 subtype AIV strains

表2 8个基因片段的基因型组成Table 2 The genotypes of H9N2 subtype Avian influenza virus