布鲁氏菌分泌蛋白BspJ多克隆抗体的制备

马忠臣，胡尊楠，王 震，郑 炜，王 勇，陈创夫

（1.石河子大学动物科技学院，石河子832000；2.西部地区高发病人兽共患传染性疾病防治协同创新中心，石河子832000）

布鲁氏菌（Brucella）感染引起的疾病称为布鲁氏菌病（Brucellosis），简称布病[1]。该病是人畜共患性疾病，家畜感染会引起母畜流产、公畜睾丸炎等，人感染后会引起关节疼痛、波浪热等[2]，其流行范围广，危害大，严重阻碍畜牧业发展。

布鲁氏菌是胞内寄生菌，其侵入机体后早期会以包涵体的形式存在于布氏小体（bracht-W-chter bodies，BCV）中，通过与内吞及分泌途径组分相互作用确保其生存；中期阶段BCV的成熟会抑制布鲁氏菌与溶酶体的结合，逃避机体的杀伤机制；后期BCV与分泌途径相互作用进而与内质网融合，其还会与内吞途径相互作用，引发自噬，满足布鲁氏菌胞内长期的寄生与繁殖[3-4]。二元调控系统BvrR/BvrS和Ⅳ型分泌系统（T4SS）是布鲁氏菌的主要调控系统，在布鲁氏菌致病机制和毒力方面发挥重要作用[4-5]。酸化是BCV成熟的重要一步，其会诱导T4SS的表达，这对布鲁氏菌胞内复制环境的生成十分有利[4]。在T4SS分泌的毒力蛋白进入宿主细胞后，会影响细胞信号通路（凋亡、自噬等）和保护自身安全。研究表明，T4SS分泌蛋白BspA、BspB、BspF在布鲁氏菌感染过程中会抑制宿主细胞的分泌和凋亡[6]。BspJ作为分泌蛋白，被分泌后存在于宿主细胞核及核周围，但是其主要功能与分子机制还不清晰。

本研究旨在获得原核表达蛋白rBspJ并通过免疫实验兔制备多克隆抗体，为BspJ在宿主细胞中的亚细胞定位及其功能研究奠定基础。本研究通过常规分子克隆技术扩增获得BspJ基因，构建pET28a-BspJ表达载体后转入大肠杆菌DE3诱导表达，使用His标签蛋白纯化柱纯化rBspJ，然后将rBspJ混入弗氏佐剂免疫实验兔，通过Western blot检测特异性抗体，最后采用饱和过硫酸铵法纯化多克隆抗体。

1 材料与方法

1.1 菌株、载体及试验动物 布鲁氏菌16M株、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌DE3、pET28a（+）载体由本实验室保存并提供；试验兔购自石河子大学实验动物中心。

1.2 主要试剂 pMD19-T载体、BamHⅠ限制性内切酶、XhoⅠ限制性内切酶购自宝生物工程（大连）有限公司；2×TaqPCR MasterMix、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、氨苄青霉素（Amp+）、卡那霉素（Kan+）、DAB显色液购自天根生化科技（北京）有限公司；T4 DNA连接酶、绵羊抗兔IgG、脱脂奶粉、Immobilon-NC Transfer Membrane购自北京索莱宝科技有限公司；BCA试剂盒、细胞总蛋白提取试剂盒购自Thermo公司。

1.3 引物设计 GenBank中查找BspJ基因序列（GenBank登录号：DK63_2140），大小为534 bp，采用Primer Premier 5.0软件设计其引物，上、下游引物分别引入BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点。BspJ-F：5'-CTCGAGATGAAGAGCTTGCAGTTTTC-3'，BspJ-R：5'-GGATCCTTATCGATATGCCCGAGGT AC-3'，引物由昆泰锐（武汉）生物技术有限责任公司合成。

1.4 pMD19-T-BspJ克隆载体的构建 在生物安全实验室中将活化的布鲁氏菌16M株置于两个无菌2.0 mL离心管中，在80℃恒温水浴锅中加热30 min灭活，以此为模板，使用设计好的引物进行目的基因的扩增，扩增体系（50 μL）：2×TaqPCR MasterMix 25.0 μL，ddH2O 19.4 μL，模板4.0 μL，BspJ-F 0.8 μL，BspJ-R 0.8 μL。扩增条件：95℃预变性5 min；94℃变性40 s，60℃退火30 s，72℃延伸70 s，30个循环，72℃终延伸10 min；4℃保存。取10 μL PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳（145 V 120 mA，30 min）。紫外灯下观察，拍照留存。

DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收剩余的40 μL PCR产物，16℃条件下过夜连接至pMD19-T载体，构建pMD19-T-BspJ克隆载体，转入大肠杆菌DH5α后接种于氨苄抗性的平板上，经过挑菌、菌液PCR（体系及条件同上）、双酶切鉴定阳性克隆，并送阳性克隆至昆泰锐（武汉）生物技术有限责任公司测序。

1.5 pET28a-BspJ表达载体的构建 使用BamHⅠ、XhoⅠ限制性内切酶酶切测序正确的阳性质粒pMD19-T-BspJ，回收BspJ基因片段，16℃连接至pET28a（+）载体，构建pET28a-BspJ表达载体，转入大肠杆菌DH5α，涂布于卡那抗性的平板，倒置培养过夜，挑取单克隆菌落进行菌液PCR检测，提取质粒后进行双酶切鉴定，将阳性质粒送至昆泰锐（武汉）生物技术有限责任公司测序。

1.6 rBspJ的诱导表达及纯化 提取pET28a-BspJ质粒，转入大肠杆菌DE3，活化后接种至20 mL Kan+的LB液体培养基中，37℃摇床培养至D600值为0.7，加入终浓度1 mmol/L的IPTG诱导表达菌，收集0、2、4、6、8 h的表达菌，混入蛋白上样液后100℃金属浴10 min，进行SDS-PAGE分析。

扩大培养活化菌800 mL，待D600值达到0.7时，加入终浓度1 mmol/L的IPTG诱导至最佳时间，4℃离心机收集全部菌体，加入适量菌体裂解液重悬菌体，于液氮和42℃水浴锅中反复冻融3次，冰浴下超声破碎1 h，吸取超声后蛋白液离心，取上清液及包涵体分别进行SDS-PAGE分析，获得的重组蛋白命名为rBspJ。

对于包涵体蛋白的纯化，首先使用8 mol/L尿素溶解包涵体，离心后取上清液过0.45 μm滤膜，然后使用His标签蛋白纯化柱纯化目的蛋白。纯化后的蛋白依次通过6、4、2、1 mol/L尿素和去离子水进行透析复性，复性后的蛋白使用蔗糖进行浓缩，BCA试剂盒测定蛋白浓度，纯化蛋白rBspJ置于-80℃保存。

1.7 rBspJ多克隆抗体的制备 将纯化的rBspJ蛋白混入弗氏佐剂免疫健康状态良好的实验兔，免疫程序：第1 d，耳静脉采集1～2 mL血液，留作阴性对照；第2 d，第一次免疫，将800 μg蛋白混入等体积的弗氏完全佐剂，皮下五点注射实验兔；第23 d，第二次免疫，将800 μg蛋白混入等体积的弗氏完全佐剂，皮下五点注射实验兔，耳静脉采血1 mL；第44 d，第三次免疫，将500 μg蛋白混入等体积的弗氏不完全佐剂，皮下五点注射实验兔；第51 d，耳动脉采血2 mL，Western blot鉴定抗体产生情况；第65 d，第四次免疫，将500 μg蛋白混入等体积的弗氏不完全佐剂，皮下五点注射实验兔；第72 d，耳动脉采血2 mL，Western blot鉴定抗体产生情况；第75 d，颈动脉采血50 mL。

使用饱和硫酸铵法纯化多克隆抗体，兔血清与等体积的生理盐水混合，再加入与混合液同样体积的SAS，4℃过夜；12 000×g，4℃离心后弃上清液；生理盐水溶解沉淀，加入适量饱和硫酸铵，4℃放置1 h；12 000×g，4℃离心，弃上清液，加入生理盐水溶解沉淀，加入适量饱和硫酸铵，4℃放置1 h；少量生理盐水溶解沉淀，装入透析带，加入PBS 4℃透析，-20℃保存。

1.8 多克隆抗体的鉴定 使用Western blot鉴定多克隆抗体的特异性。真核表达载体pDsRed2-c1-BspJ转入HEK239T细胞，荧光显微镜观察到红色荧光蛋白后，提取细胞总蛋白，混入蛋白上样液进行SDSPAGE分析，切下目的胶块200 mA恒流转膜24 min，5%脱脂奶粉37℃封闭2 h，一抗（兔血清，稀释比为1∶100）37℃孵育1 h，二抗（绵羊抗兔IgG，稀释比为1∶20 000）37℃孵育1 h，加入DAB显色液显色5 min，拍照留存。

2 结果

2.1 pMD19-T-BspJ克隆载体的构建 以布鲁氏菌16M株为模板，成功扩增出约534 bp的目的片段（图1），目的片段连接至pMD19-T载体，经过菌液PCR、双酶切筛选出阳性克隆，测序结果与目的基因相似性为100%，表明成功构建pMD19-T- BspJ克隆载体。

2.2 pET28a-BspJ表达载体的构建 克隆基因连接至pET28a（+）载体，转入大肠杆菌DH5α后，经过菌液PCR验证，成功扩增出约534 bp基因片段（图2），双酶切鉴定结果显示成功切出目的片段（图3），测序结果也显示插入的片段序列正确，以上结果均表明，成功构建出pET28a-BspJ表达载体。

图1 BspJ基因的PCR扩增Fig.1 PCR amplification of the BspJ gene

图2 菌液PCR验证Fig.2 PCR results of bacterial solution

图3 pET28a-BspJ表达载体的双酶切鉴定Fig.3 Double restriction enzyme digestion of pET28a-BspJ expression vector

2.3 重组蛋白rBspJ的诱导表达及纯化 将表达菌活化后进行诱导表达，收集诱导后0、2、4、6、8 h表达菌，同时设置空菌、空载体对照，进行SDS-PAGE分析。结果显示，2、4、6、8 h均诱导出约24 kDa的蛋白，并且8 h时表达量最高（图4）；蛋白可溶性分析结果显示，rBspJ主要以包涵体的形式进行表达，上清液中表达量比较少；使用包涵体蛋白的纯化方式成功纯化出目的蛋白（图5）。

2.4 多克隆抗体的鉴定 Western blot鉴定结果显示，22 kDa附近区域，制备的多克隆抗体与真核表达的rBspJ蛋白成功结合（图5），表明多克隆抗体具有良好的特异性，这为BspJ蛋白的真核表达鉴定及亚细胞定位奠定基础。

3 讨论

图4 诱导表达的rBspJ的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of rBspJ induced

T4SS是一个重要的毒力因子，病原菌通过T4SS可释放效应分子（主要是分泌蛋白、核酸等）入宿主细胞[7-10]。许多革兰氏阴性菌，如布鲁氏菌属、嗜肺军团属、幽门螺杆菌、巴尔通体、伯克氏菌等，均使用T4SS分泌效应蛋白进入宿主细胞，这是其致病过程的重要一步[9,11-13]。已发现的布鲁氏菌效应蛋白的数量已多于19个[14]，BspJ是新发现的分泌蛋白，其易位途经还有待更深一步的研究。TEM1报告子融合蛋白试验显示，BspJ蛋白是依赖T4SS分泌的蛋白；而CyaA报告子融合蛋白试验显示，C端融合CyaA报告子的BspJ蛋白是依赖T4SS分泌的蛋白，而N端融合CyaA报告子的BspJ蛋白不是依赖T4SS分泌的蛋白；这些结果表明，报告子的位置可能会干扰易位信号和影响BspJ的分泌，另一种可能是，布鲁氏菌分泌蛋白BspJ可能是通过一个以上的易位系统混合易位而不仅仅依赖T4SS进行分泌[6]。已有研究显示，沙门氏菌SptP[15]和耶尔森氏菌YplA[16]可以通过Ⅲ型分泌系统（T3SS）和鞭毛输出系统分泌效应物进入到宿主细胞。布鲁氏菌确实有组装为功能鞭毛的全套编码基因，在一些强毒的布鲁氏菌株中，可以观测到成型的鞭毛，但不是所有的编码基因都表达[17-19]。因此，我们推测T4SS和鞭毛在布鲁氏菌中共同起调节作用[20]，一些布鲁氏菌的分泌蛋白可能被鞭毛输出途径靶向并易位到宿主细胞，该途径仍有待试验验证。

图5 多克隆抗体的SDS-PAGE（A）和Western blot（B）鉴定结果Fig.5 SDS-PAGE(A) and Western blot(B) identification results of polyclonal antibodies

本研究通过原核表达的方式获得rBspJ蛋白并制备多克隆抗体，将为BspJ在真核细胞中的亚细胞定位及其功能验证奠定实验基础。通过大肠杆菌进行原核表达，操作简便，表达量高，表达后蛋白质功能较完全，已被越来越多的应用。但是由于菌种特性、诱导方式等原因，蛋白多以包涵体的形式进行表达，这为蛋白的纯化及后续的实验增加了难度[21-25]。本研究通过构建pET28a-BspJ表达载体转入大肠杆菌DE3进行诱导表达，控制IPTG诱导浓度（终浓度为1、2和4 mmol/L）、诱导时间、诱导温度（37、25、15℃）等条件，确定了37℃条件下，IPTG终浓度1 mmol/L诱导8 h时rBspJ表达量最高，但是rBspJ均以包涵体蛋白的形式表达，这可能与蛋白的结构及功能特性有关。另外，在蛋白透析过程中，由于蛋白特性及结构的原因，透析液的PH值将会影响某些蛋白的特性，引起蛋白变性析出，通过上下调节PH值可缓解可逆的蛋白变性。Western blot鉴定显示，将rBspJ蛋白混入弗氏佐剂免疫实验兔，免疫后15 d采集血清进行抗体检测，首次检测到特异性抗体，抗体产生的速率与蛋白质特性、弗氏佐剂量、物种特性也有一定的关系，这在一定程度上可为动物免疫实验提供参考数据。

本研究接下来的重点将是验证BspJ蛋白在宿主细胞中的表达，进行BspJ蛋白亚细胞定位研究，为BspJ蛋白功能及布鲁氏菌致病机制研究奠定基础。