佐剂对两种旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂免疫影响的研究

刘照琨,关靖喆,路丽群,于鹏成,刘明旭,吴丽佳,路义鑫

(东北农业大学动物医学学院 动物疾病防控技术与制剂创制重点实验室,黑龙江 哈尔滨 150030)

旋毛虫病是一种危害严重的人兽共患寄生虫病,因生食或食用未煮熟含有感染性包囊的肉类食品而感染,呈全球性分布,危害严重[1]。丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serine protease inhibitor,SPI)是一类对丝氨酸蛋白酶活性有抑制作用的蛋白质超家族。多个研究表明,寄生虫SPI不但能够通过调节蛋白酶活性影响蛋白质代谢参与凝血、炎症反应等许多生理和病理过程,而且也是生物体免疫系统的重要组成部分[2-4],旋毛虫SPI能够抵制宿主的免疫反应,在虫体与宿主相互作用中发挥着重要的作用。

佐剂常用来增强免疫效果,筛选适宜的佐剂尤为重要。为了探讨不同佐剂类型对两种SPIs(TsAd-SPI和TsKaSPI)的免疫效果的影响,本试验选取铝佐剂、Montanide ISA206和弗氏佐剂研究了其对BALB/c小鼠的免疫保护作用,为进一步研究SPIs与宿主的相互作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物及重组蛋白 试验用旋毛虫(Trichinella spiralis)T1分离株(ISS3),由东北农业大学寄生虫教研室用健康的昆明系小鼠持续传代保存。6～8周龄雄性BALB/c小鼠,购自辽宁长生生物公司；TsAdSPI和TsKaSPI重组蛋白由本实验室已成功构建的载体经IPTG诱导表达,纯化后获得。

1.2 主要试剂 弗氏佐剂(FCA/FIA)、铝佐剂(Alum)、IgG1、 IgG2a,均购自 Sigma Aldrich 公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG,购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Montanide ISA 206佐剂,购自 Seppic公司；其他试剂,购自国内外生物公司。

1.3 试验分组及免疫程序 将60只6～8周龄雄性BALB/c小鼠随机分为6组,每组10只,每种蛋白3组,分别为高剂量组、中剂量组、低剂量组,将纯化后的两种重组蛋白分别用PBS稀释后,以腹腔注射的方法免疫小鼠。初次免疫加完全弗氏佐剂,加强免疫用不完全弗氏佐剂,每次免疫高、中、低剂量组每只分别接种100、50 μg 和 20 μg,免疫 3 次,间隔2周。根据小鼠血清抗体的水平,选择抗体效价最优的50 μg/只免疫剂量进行佐剂比较试验。另将160只BALB/c小鼠随机分为两种蛋白的弗氏佐剂组、氢氧化铝组、Montanide ISA 206组和 PBS对照组,共8组,每组20只。两种蛋白的4个组均以最优剂量50 μg/只进行免疫,共免疫 3次,间隔 2周。弗氏佐剂组：首次免疫加完全弗氏佐剂,加强免疫用不完全弗氏佐剂,氢氧化铝组和 Montanide ISA 720组：3次免疫分别用相应的佐剂；PBS对照组：3次每只均注射 PBS 100 μL。

1.4 血清抗体检测 免疫前及免疫后第1、3、5周对每组免疫小鼠眼球取血,分离血清。1 μg纯化后的两种重组蛋白用包被液稀释后,每孔100 μl分别包被96孔ELISA板,4℃ 过夜。洗涤后,将收集的不同剂量及不同佐剂组小鼠免疫前及免疫后第1、3、5周的血清样本用封闭液1∶200倍稀释,37℃ 孵育1.5 h。洗涤后,每组分别加入封闭液1∶5 000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG；三免后(第5周)的血清加入封闭液1∶500倍稀释的 Ig G1和 Ig G2a,37℃ 孵育1 h。洗涤后加底物显色液,用酶标仪于波长450 nm测定吸光度值。

1.5 攻虫感染 末次免疫后2周,不同佐剂组每只小鼠均经口感染500条旋毛虫肌幼虫。攻虫后第1、3、7、10天剖杀小鼠,取出小肠,纵向剖开后剪成2～3 cm片断,除去小肠内容物,放入盛有生理盐水的平皿内,置于37℃孵育3～4 h,显微镜下计数成虫,计算减虫率。

1.6 数据分析 应用EXCEL,GraphPad Prism 5软件对实验数据进行统计和分析。统计学上处理实验数据以均数±标准差(x±s)表示,同时采用GraphPad Prism 5软件进行f检验、方差分析与相关分析。

2 结果

2.1 两种重组蛋白的表达及纯化 将实验室保存TsAdSPI和TsKaSPI表达载体经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE检验诱导结果,纯化后的两种蛋白TsAdSPI和TsKaSPI,SDS-PAGE检验目的条带单一,大小正确,如图1和图2所示。

图1 重组蛋白TsAdSPI纯化结果分析

图2 重组蛋白TsKaSPI纯化结果分析

2.2 两种蛋白不同剂量组结果分析 用20、50、100 μg TsAdSPI和TsKaSPI分别与等体积弗氏佐剂乳化后免疫小鼠,与免疫前(0周)相比均使重组蛋白特异性 IgG水平显著升高。在二免后,两种20 μg重组蛋白免疫组 IgG水平均显著低于50 μg和100 μg 免疫组(P ＜ 0.001),而 50 μg 免疫组与100 μg免疫组 IgG水平无显著差异(P＞0.05),如图3和图4所示。因此,两种蛋白均选择50 μg为最优免疫剂量。

图3 不同剂量TsAdSPI免疫小鼠IgG分析

图4 不同剂量TsKaSPI免疫小鼠IgG分析

2.3 两种蛋白不同佐剂组结果分析

2.3.1 特异性抗体IgG检测 TsAdSPI和TsKaSPI分别与弗氏佐剂(FCA/FIA)、铝佐剂(Alum)、ISA 206佐剂乳化后免疫小鼠,与对照组相比均诱导TsAdSPI和TsKaSPI特异性 IgG水平显著升高(图5、图6)。两种蛋白的铝佐剂组 IgG水平与弗氏佐剂组无明显差异。ISA 206免疫组IgG水平二免后明显低于弗氏佐剂组,但在三免后IgG水平明显升高,并高于弗氏佐剂组。

图5 不同佐剂TsAdSPI免疫小鼠IgG分析

图6 不同佐剂TsKaSPI免疫小鼠IgG分析

不同佐剂免疫组小鼠与对照组小鼠相比抗TsAdSPI和TsKaSPI特异性 Ig G1及IgG2a的水平均显著升高(P＜0.001),3种佐剂免疫组之间无明显差异(图7、图8)。两种重组蛋白分别与3种佐剂乳化后免疫小鼠均可诱导机体产生混合型Ig G1/Ig G2a(Th1/Th2)反应,并以 Ig G1(Th2)为主。

图7 不同佐剂TsAdSPI免疫小鼠IgG亚型分析

图8 不同佐剂TsKaSPI免疫小鼠IgG亚型分析

2.3.2 成虫减虫率 TsAdSPI的铝佐剂、ISA 206佐剂、弗氏佐剂免疫组小鼠在感染后第1、3、7、10天成虫减虫率分别为：41.05%、45.26%、53.15%；19.20%、26.72%、30.11%；17.20%、23.23%、18.68%；29.57%、33.85%、25.98%,3种佐剂免疫原均可诱导产生抗旋毛虫成虫感染相似的免疫力,ISA 206佐剂组稍优于其他两组,如图9。TsKaSPI的铝佐剂、ISA 206佐剂、弗氏佐剂免疫组小鼠在第1、3、7、10 天成虫减虫率分别为：22.22%、20.14%、17.36%；21.67%、21.33%、25.42%；23.42%、24.83%、19.05%；24.10%、25.47%、22.05%,铝佐剂及ISA 206佐剂组减虫率相近,均优于弗氏佐剂组,如图10。

图9 不同佐剂TsAdSPI免疫小鼠成虫减虫率

图10 不同佐剂TsKaSPI免疫小鼠成虫减虫率

3 讨论

丝氨酸蛋白酶抑制剂可以通过抑制宿主丝氨酸蛋白酶的活性,使其免受宿主体内蛋白酶类降解,从而逃避宿主的防御机制,有利于寄生虫在宿主体内入侵和存活[8]。由本实验室重组的TsAdSPI和TsKaSPI具有良好的抗原性,已被证实是旋毛虫病诊断候选抗原之一[9-10]。由于机体的免疫诱导机制非常复杂,除了与抗原本身的免疫原性强弱有关外,多种因素也影响机体对抗原的免疫应答强度及类型,包括接种途径、剂量、次数、免疫间隔时间以及免疫佐剂的类型等[11]。本研究使用3种剂量(20、50 μg 和 100 μg)的两种丝氨酸蛋白酶抑制剂TsAdSPI和TsKaSPI分别免疫小鼠,结果显示,50 μg蛋白剂量免疫组与100 μg蛋白剂量免疫组均诱导产生类似的抗体水平,且均高于20 μg免疫组,所以,50 μg可作为该抗原免疫的最优剂量。

免疫佐剂可以增强免疫应答的水平,且不同佐剂产生的免疫应答有所不同,所以在免疫应答及保护性研究中需要选择合适的佐剂制定免疫方案[12]。窦兰清[13]的研究表明,旋毛虫成虫可溶性抗原与弗氏佐剂、白油-司班佐剂、ISA 206佐剂和蜂胶佐剂乳化后免疫,4种佐剂均具有免疫增强作用。李强[1]的研究表明,佐剂 FCA/FIA、IMS1312、ISA720、Quil-A及氢氧化铝均能不同程度增强rsT87对小鼠的保护性免疫力,其中佐剂ISA720、Quil-A和氢氧化铝的保护效果更好。本研究比较了铝佐剂、弗氏佐剂和 Montanide ISA206三种佐剂对TsAdSPI和TsKaSPI两种蛋白免疫效果的影响,结果显示,3种佐剂均能诱导较高的免疫应答及成虫减虫率,与上述两位研究者的结论相一致。通过对抗体水平及减虫率的比较,ISA206和铝佐剂的保护效果更好。

旋毛虫为了成功感染宿主,必须在其寄生过程中调节宿主的免疫应答以避免其自体毁灭,同时又不至于对宿主造成严重损伤,因此旋毛虫感染时同时具备Th1和Th2型免疫应答特征[14]。本研究的IgG亚型结果显示,铝佐剂、弗氏佐剂和 Montanide ISA206各组均诱导产生了Th2为主的 Th1/Th2混合免疫应答,与以往研究结果相一致。结果表明,佐剂不能从根本上改变免疫应答,但可以影响免疫应答的强度。选择合适的佐剂能够最大限度的帮助抗原发挥诱导免疫保护作用。Montanide ISA 206在本试验中展现出了良好的免疫保护性,与传统的油乳剂相比更为稳定并且黏度低,易于注射,乳化技术较简单,易于掌握,可作为旋毛虫的免疫佐剂。