杨树花口服液的质量标准研究

贾纪萍,陈晓兰,金礼琴,丁 宁,丁诗晴

(江苏农牧科技职业学院,江苏 泰州 225300)

杨树花为杨柳科植物毛白杨、加拿大杨或同属数种植物的干燥雄花序,杨树花口服液为杨树花经提取制成的合剂[1],为红棕色的澄明液体,主要药用成分为酚苷类化合物和黄酮类化合物[2],化学成分包括芹菜素、山奈酚、水杨苷、木犀草素等[3]。杨树花口服液功能是清热解毒、涩肠止泻、化湿止痢、健脾养胃,用于马、牛、羊、猪等,可提高仔畜存活率,主要用于治疗仔猪湿热下痢[4]。

《中华人民共和国兽药典》(二〇一五年版,二部)中收载的杨树花质量标准中【鉴别】项下只有与杨树花对照药材的薄层色谱鉴别,缺少其中有效成分的薄层鉴别和含量测定,其他关于杨树花口服液检测的文献资料也较少,不能有效控制目前市场上杨树花口服液的质量。本研究对杨树花口服液中芹菜素等有效成分进行深入分析,以期为完善杨树花口服液的质量标准提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 紫外可见分光光度计(UV1800PCDS),购自上海美谱达仪器有限公司；电热恒温水槽(DK-80),购自上海精宏实验设备有限公司；超声波清洗器(KH5200B),购自昆山禾创超声仪器有限公司；电子天平(YP2001N),购自上海精密科学仪器有限公司；SHB-Ⅲ循环水式真空泵,购自巩义市予华仪器有限责任公司；LC20A高效液相色谱仪,购自日本岛津公司；BT25S电子天平(0.01 mg),购自赛利多斯科学仪器(北京)有限公司；双槽展开缸,购自瑞士卡玛公司；硅胶HSG板,购自烟台市化学工业研究所。

1.2 试剂 乙酸乙酯、甲苯、甲酸、三氯化铝、磷酸、乙醇、均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司；甲醇、乙腈为色谱纯；水为超纯水,为实验室自制。

1.3 药物准备 对照品：槲皮素对照品(中国药品生物制品检定所,批号 100081-201408,含量：99.1%),木犀草素对照品(中国药品生物制品检定所,批号：111520-201605,含量：99.6%)；芹菜素对照品(中国药品生物制品检定所,批号：111901-201603,含量：99.2%)。

杨树花口服液样品：委托扬中牧乐药业有限公司生产。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别 取杨树花口服液5 mL,用乙酸乙酯分两次提取,每次10 mL,合并乙酸乙酯层,蒸干,残渣加甲醇1 mL溶解,作为供试品溶液。另取芹菜素对照品、木犀草素对照品、槲皮素对照品适量,加甲醇制成每1 mL含0.1 mg溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国兽药典》二〇一五年版二部附录0502)试验,吸取上述四种溶液各3 μL,分别点于同一硅胶HSG薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(10∶4∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以2%三氯化铝乙醇溶液,105℃加热,取出置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。结果见图1。

图1 薄层色谱法鉴别

2.2 总黄酮测定 参照居羚和《中国药典》(二〇一五年版一部)中“天南星”[5]方法制定杨树花口服液中总黄酮测定方法质量标准如下：

2.2.1 对照品溶液的制备 取芹菜素对照品适量,精密称定,加60%乙醇制成每1 mL含12.25 μg的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密吸取杨树花口服液5 mL,置于50 mL量瓶中,用60%乙醇稀释,并定容至刻度；从此瓶中精密吸取1 mL溶液置具塞锥形瓶中,精密加入60%乙醇25 mL,密塞,称定重量,超声处理(功率250 W,频率40 kHz)45 min,放冷,再称定重量,用60%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过。精密量取续滤液1 mL,置10 mL量瓶中,加60%乙醇至5 mL,加1%三乙胺溶液至刻度,摇匀,以相应的试剂为空白,照紫外-可见分光光度法(《中国兽药典》二〇一五年版二部附录0401),在400 nm的波长处测定吸光度。

2.2.3 线性关系考察 精密吸取芹菜素对照品溶液1、2、3、4、5 mL,分别置 10 mL 量瓶中,各加 60%乙醇至5 mL,加1%三乙胺溶液至刻度,摇匀,以相应的试剂为空白,照紫外 -可见分光光度法在400 nm的波长处测定吸光度。以芹菜素对照品溶液的浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制的标准曲线回归方程为Y=0.1004X+0.01340(R2=0.999 93),结果表明,芹菜素在1.225～6.125 μg/mL与吸光度有良好的线性关系。

2.2.4 稳定性试验 按2.2.2项下方法操作,测定同一供试品溶液在不同时间的吸光度。结果表明,吸光度在5～90 min内基本稳定。

2.2.5 回收率试验 取已知总黄酮含量的供试品溶液5.0 mL于50 mL量瓶中,再加入12.25 mg/mL的芹菜素对照品溶液4 mL,按2.2.2项下方法测定,结果平均回收率为100.4%,RSD为1.66%(n=6)。

2.2.6 样品中总黄酮的含量测定 取3批杨树花口服液样品按2.2.2项下方法制备供试品溶液,测定吸光度后代入2.2.3项下线性方程中计算出浓度,测定得杨树花口服液中总黄酮以芹菜素计为10.3 mg/mL。

2.3 木犀草素含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱为Allti-ma C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相为甲醇 -0.4% 磷酸(48∶52)[6]；流速为 1.0 mL/min；进样量为 20 μL；检测波长为350 nm；柱温为30℃。在上述件下进行测定杨树花口服液样品中木犀草素峰峰形对称,与其他组分分离度好,理论塔板数≥6 000,结果见图2、图 3。

图2 木犀草素对照品溶液色谱图

2.3.2 溶液的制备 对照品贮备液的制备 取木犀草素对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1 mL含木犀草素164 μg的溶液,作为对照品贮备液。

精密吸取上述木犀草素贮备液2 mL于20 mL量瓶中,加甲醇定容,摇匀,制成每1 mL含木犀草素16.4 μg的对照品溶液。

图3 杨树花口服液供试品溶液色谱图

供试样品液的制备：精密吸取杨树花口服液5 mL,用乙酸乙酯分两次提取,每次10 mL,合并乙酸乙酯层,蒸干,残渣用色谱甲醇溶解后,转移至10 mL量瓶并定容,摇匀,滤过,滤液过0.45 μm微孔滤膜,取续滤液,即得。

2.3.3 线性关系考察 分别精密吸取木犀草素贮备溶液 0.5、1、2、2、4 mL 分别置 20、20、20、10、10 mL量瓶中,加色谱甲醇稀释至刻度,摇匀,依次注入液相色谱仪,测定峰面积。以对照品的浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,回归方程为Y=687 96X+14 642(R2=0.999 8),结果表明,木犀草素在4.1～164.0 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

2.3.4 精密度试验 精密吸取浓度为16.4 μg/mL的木犀草素对照品溶液20 μL,重复进样6次,分别测定峰面积,RSD为1.67%(n=6),结果表明该仪器精密度良好。

2.3.5 稳定性试验 精密移取杨树花口服液5 mL,按2.3.2项下方法制备供试品溶液,按2.3.1项色谱条件,分别在于0、2、4、8、12、24 h 进样,测定木犀草素峰面积,RSD值为2.62%,结果表明样品在24 h内稳定。

2.3.6 重复性试验 取同一批杨树花口服液按2.3.2项下方法平行制备6份供试品溶液,按2.3.1项色谱条件测定,记录木犀草素峰面积,RSD值为1.98%(n=6),结果表明该方法测定供试样品重现性良好。

2.3.7 加样回收率试验 精密移取已知含量的杨树花口服液9份,分别精密加入浓度为32.8的μg/mL 的木犀草素对照品溶液 2.5、2.5、2.5、5、5、5、7.5、7.5、7.5 mL,按2.3.2项下方法制备供试品溶液,按2.3.1项色谱条件测定,计算回收率。见表1,结果表明本方法的准确度较好。

表1 杨树花口服液中木犀草素加样回收率测定结果

2.3.8 样品中木犀草素的含量测定 取3批杨树花口服液样品,按2.3.2项下方法制备供试品溶液,按2.3.1项色谱条件测定,记录木犀草素峰面积,依照标准曲线中线性回归方程计算样品中木犀草素的含量,测定结果见表2。

表2 杨树花口服液中木犀草素含量测定结果

3 讨论

现有资料中关于杨树花口服液介绍的文献只有7篇,其中只有1篇文献涉及杨树花口服液质量标准,为采用高效液相色谱法测定杨树花口服液中水杨苷的含量[8]；因缺少杨树花对照药材的研制单位,无法采购其对照药材,故文中鉴别部分无对照药材对照。

3.1 薄层鉴别 在薄层色谱法鉴别试验中,考察了药典方法中的乙酸乙酯-丙酮-甲醇-水(6.5∶4∶0.8∶0.8)、石油醚-乙酸乙酯-甲酸(10∶54∶0.5)[8]、乙酸乙酯-甲酸-水(7∶2.5∶2.5)[9]和甲苯-乙酸乙酯-甲酸(8∶4∶0.2)[10],最终确定本研究所用展开体系为甲苯-乙酸乙酯-甲酸(10∶4∶1)；考察了不同的类型的薄层板：硅胶H板、硅胶G板、硅胶GF254板和硅胶HSG板,结果表明,硅胶HSG板效果最好,木犀草素和槲皮素分离效果好,目标斑点清晰。

3.2 总黄酮 总黄酮测定中样品处理常用方法有超声处理和加热回流处理文献方法[11]显示超声提取效果优于加热回流提取；另外借鉴《中国药典》中方法中“精密量取供试品溶液5 mL,置具塞锥形瓶中,加1%三乙胺溶液至刻度,摇匀”,测试时供试品吸光度大于1,故调整取样量为1 mL。

3.3 含量测定 木犀草素含量测定样品提取过程中采用乙酸乙酯萃取时,分层效果不好,采用了加热和超声两种方法进行处理,试验结果表明,样品超声比加热测得的木犀草素含量高。对流动相组成考察时发现乙腈-磷酸水体系[12]槲皮素和木犀草素无法分开,分离度较差,故采用甲醇-磷酸水体系。