实验室检测在羊病防控中的应用

郭 锐,田永祥,周丹娜,刘 威,段正赢,杨克礼,刘泽文,袁芳艳,高 婷

(1.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所,湖北 武汉 430064；2.农业部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室,湖北 武汉 430064；3.动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室,湖北 武汉 430064)

近年来,随着我国养羊业的快速发展,养殖规模不断扩大。但笔者发现养羊业的集约化养殖管理水平和疫病防控技术,与养猪业相比差距较大,呈现规模化粗放式管理现象,导致羊病的种类越来越多,老病新发或新的疾病不断暴发流行,隐性感染、非典型症状和混合感染无处不在,仅靠流行病学、临床症状和病理变化难以确诊,不能及时准确制定防控措施,往往贻误疾病治疗的最佳时机,导致羊群大量死亡。因此,我国养羊业在提高饲养管理水平的同时,一定要重视实验室检测在羊病防控中的应用,笔者结合自身多年在家畜传染病实验室检测和临床技术服务积累的经验,总结了以下几点内容供广大兽医工作者参考。

1 实验室主要开展的工作

实验室检测内容主要包括：抗体检测、病原检测、药敏实验。养殖户可根据不同的检测目的,选择不同的检测项目。

1.1 抗体检测 抗体检测方法一般用于羊群免疫疫苗后进行保护效果评价,常用酶链免疫吸附试验(ELISA)检测羊群的血清,该法的优点是操作简单、时间短、可同时检测大量样本,对人员要求不高。但目前抗体检测试剂盒还不能区分抗体是由疫苗株还是野毒株产生的,只有通过有没有免疫过疫苗进行区分。实验室目前主要使用的是已经商品化的试剂盒。

1.2 病原检测 病原检测主要有两种方法：一种是病原分离鉴定,如细菌培养、动物接种等直接检测某种病原微生物是否存在,通过微生物的形态、生化特性来进行定型；另一种是采用荧光定量PCR、胶体金等方法,检测样品中某种病原微生物的核酸是否存在。第一种方法做起来费时费力,第二种方法便利快捷,在较短时间就能得到结果,所以目前病原检测主要采用的是第二种方法。荧光定量PCR检测针对的是病原,针对性强、可确诊,可确定病毒载量,确定发病的主要原因,但该方法对人员和仪器有一定的要求,需专业人员操作,专业人员需要有一定的分子生物学基础。目前很多科研院所正在研发一种胶体金免疫层析定量分析仪,体积小可随身携带,可以插入不同的抗原抗体胶体金试纸条,进行定性和定量检测,未来几年必将大量运作到在羊病现在的检测中[1]。

1.3 药敏试验 通过病原检测确定致病的主要致病细菌,对其进行药敏试验筛选敏感抗生素,一旦发生疫情就能及时使用敏感药物进行治疗。如羊链球菌、羊大肠杆菌、羊巴氏杆菌、羊表皮脓包(金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌)等病,通过药敏试验治疗效果很好。

2 实验室检测对羊病防控的意义

2.1 掌握羊群的健康状况,找到早发现、早预防、早诊断、早治疗。随着高科技手段在兽医领域的广泛应用,动物疫病检测技术也得到了普及推广和提升,实验室检测、诊断水平的提高,为防控动物疫病提供了重要依据。通过病原学检测,可以了解羊群是否携带或感染某种病原,定期检测血清学的变化就可以做到防患于未然,及早发现问题,及早采取措施,起到一种预警的作用；通过抗体检测可以了解羊群的整体免疫状况,从而为相应措施的采取提供依据。

2.2 免疫程序制定和评估疫苗效果 在动物免疫中,通过实验室检测分析各地区流行病原种类、饲养模式、营养水平、品种等差异导致疫苗抗体水平不同,以及结合比较不同厂家疫苗产生保护性抗体最早时间、维持时间、离散度和最高滴度等指标,制定适合本场的最佳疫苗免疫程序是十分必要的。特别是在使用疫苗尤其是活苗的时候,一定要考虑母源抗体的影响,最可靠和可行的方法就是通过血清学检测来测定母源抗体的消长,来确定免疫接种的最佳时机。

2.3 确定发病“元凶”,实现疫病净化 对规模养羊场来说,通过1年左右时间的定期实验室检测,基本就能掌握该羊场主要发病的病原种类,那个阶段羊群容易发病,然后通过采取免疫、淘汰和检测三方面结合对该病原实现净化,如：布鲁菌病、小反刍兽疫等疾病。

3 实验室样品的采集和送检工作

3.1 样品采集前的准备工作

3.1.1 明确采样目的 要做疫病监测还是疫病诊断,目的不同采样的方案也会不同。监测以采集正常羊群血样为主、病料为辅,样品数量大；诊断以采集发病羊群病料为主。

3.1.2 做好详细的记录 畜主姓名和地址、品种、性别、年龄、临床症状、眼观病变表现(包括大小和位置)、已经采取的措施(如有)、上次治疗后复发的时间以及该群动物的发病率/死亡率、相关疫苗免疫情况。如果怀疑为人兽共患病,应在送检单中明确标注,提醒实验室检测人员注意。

3.1.3 采样物品的准备 器械：包括采样箱、保温箱、酒精灯、酒精或者碘酒棉球、各规格的一次性兽用注射器和采血管等,灭菌好的大小解剖取样器械、各种规格的离心管、玻璃瓶子、平皿、载玻片等,试管架,无菌棉球,胶带,密封袋和冰袋等。记录用具：包括记号笔、登记表、标签纸等,务必和器械类分开放置。样品保护液：病料保存液(蒸馏水、生理盐水、30%甘油缓冲液等)、固定液(95%酒精、10%福尔马林溶液)。防护用品：根据需要应包括：口罩、防护眼睛、胶靴、乳胶手套、连体服、防护帽、消毒液和喷壶、肥皂或者洗手液、手盆等。

3.2 样品采集操作技术 尿：排尿时,用1次性消毒塑料杯接取20～30 mL。粪：用棉拭子从直肠采集。脓汁、胆汁：用注射器吸取放入灭菌试管中。淋巴结、肺、肝、脾、肾等有典型病变部位采集1～2 cm3的组织块,置灭菌容器中。血液：羊前腔静脉采血。无菌采取10 mL,分别置于无抗凝剂和有抗凝剂的采血管中。肠：用线扎紧一段肠道的两端,然后将两端切断,放入灭菌容器中。口疮、水疱性疾病样品则采取水疱皮、水疱液放入50%甘油缓冲盐水中。流产胎儿整个装入不透水的容器内。

3.3 采样过程中的注意事项

3.3.1 做好人员防护 采样人员必须戴好手套、口罩、帽子,穿好工作服等防护用品后,才能进行采样操作,以减少被感染的机会(炭疽、布鲁菌病、口蹄疫等)。死因不明的动物尸体在解剖前应先对病情、病史加以了解、详细进行检查,如疑为炭疽(急性死亡、天然孔出血),切不可解剖,经取末梢血液检查排除炭疽后,方可解剖检查,并采集病料。

3.3.2 选择好最佳采样时机 采集的病料力求新鲜。能进行活体采集的病料尽量进行活体采集,如采集血液、乳汁、尿液以及鼻拭子等。患病动物死亡后,随着时间的延长,尸体腐败,组织器官的病理变化会发生一定程度的改变,病原体种类也可能增加,有碍于病原体的检查。因此内脏病料的采集,须于患病动物死亡后立即进行,一般不超过6 h,夏季最好不要超过4 h,冬季北方可适当延长至24 h。

采集全血液样品时,被采羊群一般最好先禁食8 h。如果检测病毒,最好在体温升高,发病初期采集,对于怀疑带毒而没症状的动物,最好被隔离7 d以前采样。在平时做抗体检测时,应采集两次,第一次是在理论上抗体最先出现的时期采集,第二次是在理论上抗体快要达到消长的末期时采集。

用作寄生虫检测时,要根据被检测寄生虫的特点,决定相应的时间和采血的部位,制成血涂片等。

3.3.3 采集有典型性针对性的适量样品 诊断时一样本最好发病初期(未用药),临床症状明显期采集5只以上病死和发病动物的有病变的器官组织、血清和抗凝血各10份。

免疫效果监测时--动物免疫后14～20 d,随机采集同群动物血清样品30份。

3.3.4 病料采集 全过程要求无菌操作,做到一畜一套器械,防止样品交叉污染。

3.4 样品的处理 病理组织学检测样品：要想使试验诊断得出正确结果,除采取适当的病料外,需使病料保持或接近新鲜状态,为此需对病料进行处理。采用10%福尔马林液(10%甲醛溶液)或95%酒精等固定。固定液体积应为病料的10倍。如用10%福尔马林固定组织,经24 h必须更换1次新鲜溶液。神经系统组织需使用10%福尔马林,并且加入5%～10%的碳酸镁。

细菌学检测样品：一般用灭菌的液体石蜡、30%甘油缓冲盐水或饱和氯化钠溶液来保存病料。

病毒学检测样品：一般使用50%甘油缓冲盐水,需作组织学检查的材料最好使用包音氏固定液或岑克氏固定液。

血清学检验材料：从发病羊无菌采取血液,注入灭菌试管中,室温或37℃放置0.5～1 h(有利血清自然分离),然后4℃冷藏[2]。

3.5 样品送检 一般采集样品后必须24 h内送抵实验室,放在4℃左右的容器中运送。送检病料的容器一般采用保温箱或泡沫盒,内置冰块进行运输。送检越快越好,避免病料接触高温和阳光,以免病料腐败或病原体死亡。送检过程中要防止倾倒、破碎、避免样品泄漏,要注意有的样品不能剧烈震荡,要注意缓冲放置,所有样品都要贴上能标示采样羊的详细标签[3]。

4 样品采集过程中的主要事项

4.1 病样要新鲜 最好采集使用抗生素前的病料,新鲜性且有一定数量,每份样品单独分装好标注好。

4.2 血样溶血的3种原因 送检的血样有溶血现象,可能是以下3种原因造成：(1)消毒采血部位时,酒精未干即行采血,有可能混进酒精造成溶血；(2)血清未分离出,携带血液经坐摩托车、拖拉机等剧烈震荡,使血细胞破裂引起溶血；(3)血液存放的容器不洁。

4.3 病料采集顺序 采集病料的顺序同解剖检查的顺序,即先胸腔后腹腔、先实质器官后管状器官。如需要细菌分离检测,最好是解剖与接样同时进行,避免外界环境中细菌污染。

4.4 结合实际情况采集 在实际采样工作中,应结合流行病学特点、临床症状和剖检变化,大致怀疑是何种疫病,根据该种疫病的特点和需采取的检查方法不同,采集相关的病料(见表1)。

5 检测报告分析及注意事项

5.1 分析检测报告的人必须是最熟悉养殖场的人 熟悉生产中的各个环节,知道免疫程序是什么样子,知道各个阶段羊群免疫效果、发病率、死亡率,现在成为一名合格的兽医,必须从传统的治疗兽医或保健兽医转变成管理兽医,拿到检测报告后结合之前每个季度的检测报告,马上就能推算出问题出在哪里,后期可能那些羊群还会出现什么问题?应急措施有哪些?(不能完全依赖检测机构的建议,除非知道你羊场1年以上详细的病原和抗体检测报告,生产环境和管理方式非常了解)。

表1 常见羊病病原检测推荐采集部位

5.2 关注“离散度” 抗体离散度是指所测的样品值与所有样品平均值的距离,距离越大,离散度越大,它是衡量一个羊群检测值均匀度的一个重要指标,其高低可以反映羊场在免疫后抗体水平的整齐度,为评价规模化羊场整体免疫效果重要指标。以小反刍兽疫为例：群体免疫合格率与抗体离散度成反比关系,群体免疫合格率高,则抗体离散度低；反之,群体免疫合格率低,则抗体离散度高。合格标准：群体的离散度一般≤40%,种畜的离散度要求≤20%,商品畜可以放宽到≤25%。

6 总结

羊场疫病监测不能完全依赖抗体水平监测,必须病原检测和抗体检测相结合,因为抗体水平的形成很复杂,有的是打疫苗引起的,有的是自然感染的野毒引起的。我们在分析检测结果的时候,不能用样本阳性率去单一分析,需要结合离散度、平均抗体水平、临床症状和生产水平综合分析。同时在依据实验室检测结果制定防控方案之前,一定要与送检测场兽医负责人详细的了解实际情况,这样实验室检测结果才能发挥最大的指导作用。