CD22 CAR-T挽救治疗CD19 CAR-T治疗后短期复发的TP53突变阳性难治急性B淋巴细胞白血病一例

穆娟，吕海容，李静怡，江嫣雨，张蕊，孟娟霞，袁婷，邓琦

成人急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是最常见的成人急性白血病之一，占成人急性白血病的20%～30%［1］。携带TP53基因突变的B细胞ALL患者缓解率低、易复发、生存差，异基因造血干细胞移植是其公认的有望得到治愈的治疗手段［2-3］。采用抗CD19嵌合抗原受体修饰（chimeric antigen receptor，CAR）的T细胞治疗复发/难治性（relapsed or refractory，R/R）B细胞ALL可达70%～90%的应答率［4-5］。CD22在B淋巴细胞中也有表达，对于CD19 CAR-T治疗失败的患者，可采用CD22 CAR-T细胞治疗。我院收治1例携带TP53基因突变的难治性Ph-ALL患者，经自体CD19 CAR-T细胞治疗缓解后14 d复发，其外周血CD19 CAR-T细胞消失的同时检测到CD19 CAR的DNA拷贝数异常增高；后予以自体CD22 CAR-T细胞治疗达到完全缓解（complete response，CR），桥接单倍体异基因造血干细胞移植治疗，病情稳定，现报告如下。

1 病例报告

1.1 病例资料 患者 女，31岁。主因乏力、皮肤出血点伴低热10 d，于2018年6月7日入本院。患者10 d前无诱因出现乏力、皮肤出血点，伴有发热，体温最高37.4℃，就诊于当地医院，查血常规：白细胞计数3.4×109/L，血红蛋白132 g/L，血小板计数33×109/L。骨髓穿刺：急性淋巴细胞白血病，原幼淋巴细胞93%，为进一步治疗于我院就诊。既往体健。入院血常规：白细胞计数8.71×109/L，血红蛋白100 g/L，血小板计数35×109/L。骨髓细胞学：急性淋巴细胞白血病，增生活跃，原淋89%；白血病免疫分型（图1）：93.9%细胞为恶性原始B淋巴细胞，表达CD19+CD10+CD20+CD38+CD22+，部分表达CD33+；TP53基因突变：89%；急性白血病43种融合基因阴性；染色体：正常。查体：双侧颈部、腋下腹股沟均可触及肿大淋巴结。颈部及胸腹CT：颈部、双侧腋窝及纵隔内、腹腔、腹膜后及双侧腹股沟多发增大淋巴结。确诊为携带TP53基因突变的Ph-急性B淋巴细胞白血病。明确诊断后给予VDCP方案诱导化疗：环磷酰胺1.2 g第1天，柔红霉素40 mg/m2第1～3天，长春地辛4 mg第1、8、15、22天，泼尼松60 mg/d第1～14天、第15～28天逐渐减量。化疗结束复查骨髓细胞学：原始淋巴细胞12.5%，白血病免疫分型：13.31%为恶性原始淋巴细胞，提示为部分缓解（partial remission，PR）。再次予以原方案诱导28 d，复查骨髓细胞学：原始淋巴细胞55.5%、白血病免疫分型（图1）：74.09%为恶性原始淋巴细胞，疗效评诂为未缓解（non-remission，NR）。TP53基因突变为74.5%。

Fig.1 Flow diagram of the patient图1 患者流式细胞图

1.2 检测方法 急性淋巴细胞白血病的免疫分型诊断、骨髓及外周血CD19 CAR-T、CD22 CAR-T细胞的检测，采用流式细胞术检测。CD19 CAR-T、CD22 CAR-T细胞DNA水平的检测采用实时定量PCR方法。

1.3 CD19 CAR-T细胞治疗 患者以难治B细胞ALL入组“CD19 CAR-T治疗复发难治B细胞淋巴瘤及急性B淋巴细胞白血病（ChiCTR-ONN-16009862）”临床试验。单采自体外周血单个核细胞行CD3磁珠分选作为培养CD19 CAR-T细胞的T细胞来源。经FA方案预处理：氟达拉滨30 mg/m2第1～5天，阿糖胞苷1 g/m2第1～5天；分次回输二代CD19 CART细胞：第1次回输1×106/kg，第2次回输1×106/kg。回输第1天开始出现持续高热，回输第13天体温恢复正常，回输日至回输第14天体温（38.20±1.27）℃，伴有畏寒、寒战、咽痛；监测生命体征和临床症状稳定（表1）。C反应蛋白、细胞因子升高（表2）。于回输第0、4、7、14、21、28天监测外周血CD19 CAR-T细胞（图2）；并进行CAR19的DNA检测（图3）。于回输第12天体温恢复正常，评估细胞因子释放综合征（cytokine-release syndrome，CRS）2级［6］，予以非甾体抗炎药对症处理及支持治疗。于回输第14天复查骨髓涂片：增生活跃（-），未见原始幼稚淋巴细胞；白血病免疫分型：未见原始B淋巴细胞，疗效评估达完全缓解，TP53基因突变38.44%。

Tab.1 The side effects of CD19 CAR-T and CD22 CAR-T cell treatment表1CD19 CAR-T和CD22 CAR-T细胞治疗的不良反应观察

Tab.2 Changes in cytokine levels in CD19 CAR-T and CD22 CAR-T cell treatment表2CD19 CAR-T和CD22 CAR-T细胞治疗的细胞因子水平变化

1.4 CD19 CAR-T细胞治疗缓解后的短期复发 患者达CR 2周后返院预行同胞全合异基因造血干细胞移植，复查骨髓涂片提示骨髓复发；白血病免疫分型（图1）提示51.49%为原始B淋巴细胞，表达CD19+CD10+CD20+CD38+CD22+。患者外周血CD19 CAR-T比例为0，CD19 CAR的DNA水平为424 000.3 Copies/ng gDNA，TP53基因突变52.25%。将患者第1次CAR-T治疗冻存的外周血单个核细胞复苏，重新进行CD3磁珠分选CD3+T细胞体外培养，于体外培养第4天（CD19病毒转染日）进行流式检测，可见培养体系存在1.41%的CD19+CD10+ALL细胞残留（图4）。

Fig.2 Changes in the proportion of peripheral blood CAR-T cells图2 两次CAR-T细胞治疗外周血CAR-T细胞比例变化

Fig.3 Changes of expression of CAR gene图3 两次CAR-T细胞治疗外周血CAR基因表达变化

Fig.4 ALL cells remaining in the system during the preparation of CAR-T图4 CD19 CAR-T细胞制备过程中体系残留的ALL细胞

1.5 CD22 CAR-T细胞治疗 患者CD19 CAR-T细胞治疗短暂缓解后复发，以复发难治B细胞ALL病例入组“CD22 CAR-T治疗复发难治B细胞淋巴瘤/急性B淋巴细胞白血病（ChiCTR1800019298）”临床试验。经地西他滨+FLAG［地西他滨20 mg/m2第1～5天，粒细胞集落刺激因子（G-CSF）75µg第2天-中性粒细胞恢复，氟达拉滨30 mg/m2第3～7天；阿糖胞苷1 g/m2第3～7天］预处理，回输二代CD22 CAR-T细胞：回输日2.61×106/kg。回输第1天出现发热，体温最高38.3℃，很快下降，无其他不适（表1）。C反应蛋白、细胞因子升高（表2）。于回输第0、4、7、14、21、28天检测到外周血CD22 CAR-T细胞，未检测到CD19 CAR-T细胞；并进行外周血CD19 CAR和CD22 CAR的DNA检测（图2、3）。评估CRS为1级。于第14天复查骨髓涂片：增生活跃-，未见原始幼稚淋巴细胞；白血病免疫分型（图1）：未见原始B淋巴细胞，疗效评估达完全缓解，TP53基因突变阴性。全身弥散磁共振：颈部及纵隔内、腹腔、腹膜后及双侧腹股沟未见增大淋巴结，双侧腋窝多发小淋巴结，考虑良性。

1.6 单倍体异基因造血干细胞移植治疗 患者病情稳定，移植前外周血CD22 CAR-T细胞比例1.3%，CD19 CAR-T细胞0。外周血CD19 CAR的DNA水平22 050 Copies/ng gDNA；CD22 CAR的DNA水平3 055 Copies/ng gDNA。放弃同胞全和供者，选择父供女单倍体异基因造血干细胞移植（含地西他滨：20 mg/m2移植前14 d至移植前10 d桥接的预处理方案），过程顺利。移植后14 d复查骨髓涂片及白血病免疫分型：未见原始B淋巴细胞；供者嵌合98.53%；TP53基因突变阴性。外周血CD22 CAR-T细胞0，CD19 CAR-T细胞0。外周血CD19 CAR的DNA检测1 940 Copies/ng gDNA；CD22 CAR的DNA检测阴性。于移植后28 d给予供者淋巴细胞输注（CD3+细胞1.7×107/kg），CD19 CAR的DNA水平进一步下降。患者于移植后58 d高热、皮疹、口腔溃疡，考虑急性移植物抗宿主病Ⅰ级，给予糖皮质激素缓解。目前移植后10个月，供者嵌合99.63%、TP53基因突变阴性，CD19 CAR和CD22 CAR的DNA水平仍保持阴性，拟继续给予移植后维持治疗，并密切观察疾病转归情况。

2 讨论

CAR-T治疗是近20年来极具发展前景的肿瘤过继免疫细胞治疗方法［7］，其中针对难治复发急性B淋巴细胞白血病的抗CD19 CAR-T细胞表现出令人满意的疗效［8］。尽管CD19 CAR-T在急性B淋巴细胞白血病中有显著的临床效果，但多数患者很快复发，B淋巴细胞表面CD19表达丢失或减少是CD19 CAR-T治疗失败或缓解后复发的重要因素［9-10］，但其机制尚不明确，可能是多因素作用的结果［9，11］。

本例患者在CD19 CAR-T治疗缓解后2周复发，为CD19+复发。笔者发现，其外周血CD19 CAR-T细胞消失的同时，检测到异常高表达的CD19 CAR基因，且TP53表达再度升高。遗憾的是患者复发时未能留取骨髓标本，不能进行流式分选以检测CD19 CAR基因是否存在于白血病细胞中。有文献报道1例复发B-ALL患者在接受CD19 CAR-T治疗缓解并进行造血干细胞移植治疗后9个月复发。其复发的白血病细胞为CD19-表达，但该白血病异常表达抗CD19 CAR基因，证实CD19 CAR基因被引入了单个白血病细胞中，导致最终的CD19-复发。其机制在于CD19 CAR基因的转入，与自体白血病细胞表面的CD19表位结合，使其CD19不表达，从而不能被CD19 CAR-T细胞所识别导致复发［12］。本例患者CD19 CAR-T治疗缓解后2周复发，与其CD19 CAR-T细胞制备过程中CD3磁珠分选的CD3+T细胞存在1.41%的白血病细胞残留有关，还是与TP53基因突变有关需进一步研究验证。

该患者复发后马上接受CD22 CAR-T细胞治疗获得第2次完全缓解，而且其TP53基因突变亦转阴，继而桥接单倍体造血干细胞移植治疗。随着供者干细胞的植入，患者体内异常高表达的CD19 CAR基因水平明显降低，但CD19 CAR基因水平的降低，是移植物还是移植过程中糖皮质激素的作用，笔者将继续深入研究并追踪此病例，监测其CD19 CAR基因表达水平变化，以及是否与其移植后复发具有相关性。

本例另外一个特点是其TP53基因突变为89%，为预后不良、成为难治ALL病例的重要因素之一［13］。本例治疗过程中，在CD22 CAR-T细胞治疗的预处理和异基因造血干细胞移植的预处理中，均采用了地西他滨的联合治疗，以提高疗效［14-15］。但TP53基因突变是否与CD19 CAR-T治疗缓解后2周复发具有相关性，也需进一步探讨，也是笔者继续追踪该患者移植后情况的一个重要观察指标。

CD22同样在B淋巴细胞上表达，成为难治复发急性B淋巴细胞白血病的另外一个CAR-T细胞治疗靶点［16］。CD22在大多数急性B淋巴细胞白血病病例中也表达，而且通常在免疫治疗后复发的患者中，白血病细胞CD19缺失后仍有CD22的表达，理论上可以作为CD19-复发的难治复发急性B淋巴细胞白血病患者的挽救治疗。有报道采用CD22CAR-T细胞治疗21例难治复发急性B淋巴细胞白血病，17例患者既往接受过CD19单抗免疫治疗，其中15例患者接受过CD19 CAR-T细胞治疗，其CD19均为阴性或者弱阳性，治疗结果CR率可达73%，且安全性良好［17］。此研究进而设计了一个针对CD19和CD22的双特异性CAR-T细胞小鼠动物实验，对于CD19+CD22+、CD19-CD22+的急性B淋巴细胞白血病细胞均具有良好的杀瘤效果，提示在难治复发急性B淋巴细胞白血病的诱导缓解方面可能更有效。对于本例患者，复发时大量CD19+CD22+白血病细胞，同时高表达的CD19 CAR基因，笔者给予患者CD22 CAR-T细胞治疗，期间CRS为1级，不良反应较CD19 CAR-T治疗轻，并获得完全缓解，直至接受异基因造血干细胞移植治疗，与上述文献报道结果相似。

总之，在CAR-T细胞的制备过程中应注意进一步提高磁珠分选CD3+细胞的纯度、避免混入白血病细胞；另外一个方面CD22 CAR-T治疗可以作为CD19 CAR-T治疗复发的一个挽救治疗措施、或与CD19 CAR-T联合使用以提高疗效。