不同补给水源的城市人工湖中异养菌耐药性及耐药菌种属分布研究

梁杰，张崇淼，朱聪聪，姬智乙，张佩佩，苏露馨

西安建筑科技大学，陕西省环境工程重点实验室，西北水资源与环境生态教育部重点实验室，西安 710055

人工湖作为现代城市的重要组成部分，不仅能增加水汽循环、调节区域气候，而且其景观娱乐功能也随着人们生活水平的提高显得愈发重要[1]。地表水因取用方便，水质稳定等优点，是人工湖的主要补给水源，但这对于缺水城市来说却是沉重的负担[2]。随着水资源供需矛盾的日益加剧以及污水再生处理技术的日臻完善，再生水作为城市人工湖的补给水源逐渐受到青睐[3-4]。北京奥林匹克公园的龙形水系[5]、天津生态湿地公园[6]和昆明的翠湖[7]都是再生水应用于城市人工湖的典型代表。

近年来的研究发现，城市地表水体可能是细菌耐药性传播的重要媒介[8-9]。城市人工湖耐药菌污染状况不仅关系到生态环境，也在一定程度上影响着社会公众的身体健康[10]。然而，目前我国在城市人工湖细菌耐药性污染方面的研究还处于起步阶段，污染特征和内在规律尚不甚清楚[11]。使用地表水和再生水作为补给水源，对人工湖的细菌耐药特性以及耐药菌多样性会产生何种影响，是否会造成差异化的结果，这些问题都亟待阐明。

本研究选取分别以地表水和再生水补水的2处人工湖为研究对象，通过长期取样检测，系统考察了人工湖中总异养菌群对常见抗生素的耐药状况，并对分离菌株进行耐药表型分析和种属鉴定。以期揭示不同补给水源对人工湖中细菌耐药性和耐药菌种属分布的影响，为城市水环境中细菌耐药性传播控制提供科学依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 水样采集

选择西安市的XQ湖和FQ湖为研究对象，这2处人工湖坐落于西安市主城区的2处公园内，具有景观和娱乐功能。XQ湖水面积约1.0×105m2，平均水深2 m，地表水是其补水来源，FQ湖水面面积约4.0×104m2，平均水深1.5 m，使用再生水补水。2018年4—11月，对这2处人工湖逐月进行水样采集。使用1 L水样采集器在水面下大约0.5 m处采样，每个人工湖设置5个采样点，采集5 L混合水样，置于预先灭菌的聚乙烯瓶中，在6 h内送回实验室分析。

1.2 水质指标测定

1.3 异养菌和耐药菌含量测定

使用滤膜法对水样中的异养菌进行计数[13]。将水样梯度稀释后，真空抽滤通过0.45 μm孔径的混合纤维素滤膜，将滤膜细菌截留面向上紧密贴在PCA培养平板上，30 ℃培养24 h，对菌落数量为20～200的培养平板进行菌落计数，每次检测做2个平行样。使用菌落数量的平均值计算出每100 mL水样中的异养菌数量。根据美国临床和实验室标准协会(CLSI 2017)标准[14]，在PCA平板中分别加入氨苄西林(AMP)、磺胺甲恶唑(SMZ)和四环素(TET)制备出AMP、SMZ和TET抗性平板，其中相应抗生素质量浓度分别为32、512和16 μg·mL-1。类似地，使用滤膜法测定水样中的耐药菌，计算得到水样中AMP耐药菌、SMZ耐药菌和TET耐药菌的含量。

1.4 菌株分离纯化与耐药表型检测

随机挑取PCA平板上的菌落，平板划线进行分离纯化。采用K-B纸片琼脂扩散法对分离菌株进行药敏试验，使用游标卡尺测量抑菌环直径，根据CLSI标准判定其是否为耐药菌。3种药敏纸片中的抗生素含量为：AMP，10 μg·片-1；SMZ，300 μg·片-1；TET，30 μg·片-1。使用大肠埃希氏菌ATCC25 922作为质控菌株。将分离所得的耐药菌逐一编号，菌株编号上的“XQ”和“FQ”代表其来源人工湖。

1.5 菌株种属鉴定

针对分离菌株中的耐药菌，使用细菌基因组DNA提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0，TaKaRa公司)提取总DNA。选择通用引物27 F 5’-AGAGTTTGAT-CCTGGCTCAG-3’和1492 R 5’-GGTTACCTTGTT-ACGACTT-3’，以及516 F 5’-TGCCAGCAGCCG-CGGTA-3’和1510 R 5’-GGTTACCTTGTTACGAC-TT-3’，使用梯度PCR仪(Veriti型，美国Applied Biosystem公司)对16S rDNA进行PCR扩增[15-16]，反应程序：94 ℃预变性5 min；35个循环：94 ℃变性60 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s；72 ℃延伸5 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳(JY300C型，北京君意东方电泳设备有限公司)初步判定，然后送交上海生工生物工程技术服务有限公司测序。使用BLAST对测序结果在GenBank数据库中进行序列比对，确认其种属。

1.6 统计分析

使用SPSS Statistics 18.0软件对常规理化指标、总异养菌群含量、耐药菌含量和分离出的耐药菌比例进行均值比较、相关性分析。用MEGA 7软件对耐药菌株中的气单胞菌属进行聚类分析，构建进化树。

2 结果与讨论(Results and discussion)

2.1 人工湖水体的常规理化指标

2.2 人工湖中总异养菌及耐药菌含量

表1 XQ湖和FQ湖常规理化指标的t检验结果Table 1 The t-test results for conventional physical and chemical indicators in XQ Lake and FQ Lake

图1 人工湖中总异养菌和耐药菌含量注：AMP表示氨苄西林，SMZ表示磺胺甲恶唑，TET表示四环素。Fig. 1 Total heterotrophic bacteria and antibiotic-resistant bacteria concentration in artificial lakesNote: AMP stands for ampicillin; SMZ stands for sulfamethoxazole; TET stands for tetracycline.

2.3 分离菌株的耐药表型

从XQ湖和FQ湖分别分离出61株和60株异养菌。药敏试验结果如表2所示，XQ湖中的AMP耐药菌、SMZ耐药菌和TET耐药菌的数量分别为37、11和9；FQ湖中这3种耐药菌的数量分别为42、11和5。显然，这2处人工湖分离菌株中的AMP耐药菌比例都较高(60.7%和70.0%)，而TET耐药菌则占比较低(14.8%和8.3%)，这与2处人工湖总异养菌群中AMP耐药菌和TET耐药菌含量高低状况基本吻合。对XQ湖和FQ湖每月分离出的3种耐药菌株检出率进行比较，未发现它们存在显著性差异(P>0.05)。

根据化学结构和作用机制，AMP、SMZ和TET分别归属于β-内酰胺类、磺胺类和四环素类抗生素，它们的抗菌机制各不相同：AMP主要是抑制菌体细胞壁的合成，SMZ抑制细菌叶酸合成过程中的二氢蝶酸合酶，TET则是抑制细菌蛋白质合成，从而导致细菌无法生长繁殖[19]。从XQ湖和FQ湖共分离出84株耐药菌，产生了5种耐药表型。如表2所示，对AMP单一耐药的占比高达71.4%，远高于其他表型；其次为AMP-SMZ-TET，占比14.3%；AMP-SMZ和SMZ单一耐药的占比都仅为6.0%；AMP-TET的最少，只有2.4%。由此可见，这2处人工湖中异养菌的耐药表型比较集中，对AMP单一耐药是其最主要的耐药表型。

2.4 耐药菌株的种属鉴定

分离出的84株耐药菌在生物分类学上归属于19个种。其中，XQ湖耐药菌39株，12个种；FQ湖耐药菌45株，12个种。蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)和鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)是2个湖共有的耐药菌(图2)。

从XQ湖分离的AMP耐药菌共有10个种，主要是蜡状芽孢杆菌，占比为54.1%；SMZ耐药菌和TET耐药菌分别有8个种和5个种，主要种属是肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和大肠埃希氏菌。从FQ湖分离出的AMP耐药菌有10个种，蜡状芽孢杆菌仍是主要菌株，占比54.8%；SMZ耐药菌和TET耐药菌分别有8个种和4个种，主要为维氏气单胞菌和大肠埃希氏菌。一些研究表明，从临床和食物中分离出的蜡状芽孢杆菌对β-内酰胺抗生素具有高度耐药性[20]，但对其他多种抗生素都敏感[21]。这与本研究从人工湖中分离出的蜡状芽孢杆菌的耐药特性近似。

对照已知的固有耐药菌谱[14]，可以发现从XQ湖和FQ湖中分离得到了一些对AMP的固有耐药菌，包括肺炎克雷伯氏菌、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)，但它们在分离菌株中的占比均不超过10%。这2处人工湖分离出的菌株中均不存在对SMZ或TET的固有耐药菌。

结合上述耐药性异养菌群测定结果分析可知，获得性耐药很可能是城市人工湖中细菌耐药性的主要来源。很多研究都表明，人类活动对细菌耐药性的传播有重要贡献，在污水、地表水，甚至饮用水中都发现了多种抗生素抗性基因[22-23]。此外，基因水平转移(horizontal gene transfer, HGT)在微生物群落中普遍存在，胞内DNA和胞外DNA都在细菌间的耐药性传播中发挥着重要作用[24-25]。XQ湖的补给水源为地表水，其在输送过程中流经村庄及农田时不可避免地会有耐药菌和耐药基因汇入，最终进入XQ湖；FQ湖的补给水源为再生水，其由城市污水经深度处理所得，亦含有数量可观的耐药菌和耐药基因[26]。耐药菌进入湖水后生长繁殖会增加这类耐药菌的数量；耐药基因的水平转移会扩大耐药菌的种属分布范围，二者都会导致人工湖总异养菌群耐药率的提高。此外，在XQ湖和FQ湖中分离出的耐药菌株中，大部分属于条件致病菌，有些在临床和环境样品中都经常检出，例如气单胞菌、葡萄球菌等。这在一定程度上也反映了人类活动与环境之间的交互作用。

图2 人工湖中分离的耐药菌株种属Fig. 2 Species of antibiotic-resistant strains isolated from artificial lakes

表2 XQ湖和FQ湖分离菌株的耐药表型Table 2 Antibiotic resistance phenotypes of isolates strains from XQ Lake and FQ Lake

2.5 耐药性气单胞菌的聚类分析

气单胞菌属在环境中分布非常广泛，是水环境中的主要耐药菌群之一[27]。从XQ湖和FQ湖中共分离出16株耐药性气单胞菌，分别归属于维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)。通过聚类分析构建进化树(图3)，可以发现，大多数豚鼠气单胞菌16S rDNA序列的相似性极高。相比嗜水气单胞菌，维氏气单胞菌与豚鼠气单胞菌的关系更疏远，分离出的维氏气单胞菌在进化树中的亲缘关系也更为复杂。这些气单胞菌中有10株仅对AMP耐药，1株(FQ80901)仅对SMZ耐药，5株(XQ81001、FQ81003、FQ81001、FQ81004和FQ80903)对AMP和SMZ二重耐药。从进化树来看，除了属于豚鼠气单胞菌的FQ80903之外，其余4株二重耐药菌都是维氏气单胞菌，处在相近的分支上。总体来看，维氏气单胞菌耐药谱较为多样，而豚鼠气单胞菌耐药表型较单一。值得注意的是，本研究并未发现分离来源对这些耐药性气单胞菌的聚类有明显影响，例如FQ80903、FQ80705、XQ81004和XQ805-2-01，尽管来自2处不同的人工湖，但它们在进化树中都在同一分支；也没有发现某种来源的气单胞菌具有明显的耐药性聚类特征。

图3 耐药性气单胞菌属进化树Fig. 3 Phylogenetic tree of antibiotic-resistant Aeromonas

综上所述：

(1)XQ湖和FQ湖中AMP耐药菌、SMZ耐药菌含量约为102～104CFU·(100 mL)-1，TET耐药菌含量约为101～103CFU·(100 mL)-1。2个湖共分离出84株耐药菌，71.4%都是对AMP单一耐药。蜡状芽孢杆菌是主要的AMP耐药菌。

(2)从XQ湖和FQ湖分离出的耐药菌归属于19个种，其中蜡状芽孢杆菌、大肠埃希氏菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌和鸟氨酸拉乌尔菌为2个湖共有耐药菌。仅有不足10%的细菌对AMP具有固有耐药性，没有发现对SMZ和TET具有固有耐药性的菌种。获得性耐药很可能是城市人工湖中细菌耐药性的主要来源。

(3)地表水补水的XQ湖和再生水补水的FQ湖在总异养菌含量、耐药菌含量和检出率上均无显著差异。进化树分析结果表明，分离来源对16株耐药性气单胞菌的聚类并无明显影响。