短时热处理对低温逆境下黄瓜不同部位的冷害及活性氧代谢影响

赵昱瑄，张敏,2,3*，姜雪，胡均如，李佳乐，盖晓阳

1(上海海洋大学 食品学院，上海，201306)2(食品科学与工程国家级实验教学示范中心(上海海洋大学)，上海，201306) 3(上海冷链装备性能与节能评价专业技术服务平台，上海，201306)

黄瓜(CucumissativusLinn.)作为日常生活中最常见的果蔬之一，自身水分含量达98%，含有丰富的维生素、胡萝卜素等营养成分[1]。在常温下贮藏，黄瓜的营养物质快速流失，黄瓜容易衰老并发生腐败;而适合的贮藏温度虽然能够减缓衰老[2]，防止营养物质的损失，但黄瓜在低温贮藏下会发生细胞膜的破坏，进而发生冷害[3]。黄瓜果实冷害的发生受到诸多因素的共同影响[4]，冷害对果实品质影响很大，在表面形成黑斑，随着贮藏时间的延长，果实耐贮性逐渐下降，冷害面积逐渐增大，冷害程度加深，严重影响商品价值。故对黄瓜果实进行冷藏的同时，还需采取一定的措施来减轻冷害的发生。热处理能延长水果货架期，抑制生理病害，还能提高果蔬的抗冷性，减轻冷害，并且在食用方面有一定的安全性[5]。SHAO等[6]用45 ℃热空气处理枇杷果实3 h，显著降低了枇杷的冷害发生率。李秀杰等[7]发现8 ℃热水处理 10 min 的‘鲁星’油桃可以减轻果肉褐变和腐烂，保持油桃风味。乔勇进等[8]通过对黄瓜进行37 ℃热空气处理24 h，维持了细胞膜的完整性，减轻了低温伤害，延缓了冷害的发生。IBRAHIM等[9]发现55 ℃热水处理可提高黄瓜果实CAT、APX和POD的活性，降低果实的冷害发生率。热处理同样也能提高柑橘[10]、西葫芦[11]、青椒[12]的抗冷性。黄瓜果实与果梗连接处含有一定量的苦味素也叫葫芦素C，有抗肿瘤的功能[13]，具有一定的研究价值。目前，国内外学者在热处理技术减轻果蔬冷害方面进行了大量的研究，但都限于对黄瓜果实单一部位的影响，而对果实不同部位的冷害和活性氧代谢的研究较少见报道。

本研究以黄瓜为试验材料，根据前期的二次正交旋转组合设计试验选出的4 ℃贮藏温度下最佳热处理条件(39.4 ℃热水中热激24.4 min)，测定黄瓜果实活性氧清除酶的活性以及膜脂含量对低温胁迫的变化,研究了短时热处理对低温逆境下黄瓜不同部位的冷害研究,为进一步研究热处理对贮藏保鲜与耐冷性的关系，并应用于黄瓜的贮藏保鲜提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 试剂与仪器

NaOH、抗坏血酸、H2O2、硫代巴比妥酸、乙二胺四乙酸二钠、甲硫氨酸、核黄素、三氯乙酸、无水乙醇、磷酸氢钠、冰醋酸,国药集团化学试剂有限公司；MDA测试盒、H2O2测试盒、超氧阴离子自由基测试盒、超氧化物歧化酶测试盒，南京建成生物工程研究所。

BPS-100CA 型恒温恒湿培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；HSWX-600BS 型电热恒温水温箱，上海圣科仪器设备有限公司；H-2050R-1型高速冷冻离心机，长沙湘仪离心机有限公司；THZ-82A 型恒温振荡箱，江苏省金坛市环宇科学仪器厂；GY-4型数显果实硬度计，浙江托普云农科技股份有限公司；BJ2100D型数字孔式电子天平；DDS-307 型电导率仪，上海笛柏实验设备有限公司；紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 冷害指数的测定

分别随机取15根黄瓜，观察冷害状况，判断冷害等级[14]。冷害指数共分为5个等级，即0级，无冷害；1级，冷害面积小于25%；2级，冷害面积为25%～50%，轻度冷害；3级，冷害面积为50%～75%，中度冷害；4级，冷害面积为75%～100%，严重冷害。按照公式(1)计算冷害指数，重复3次。

(1)

1.3.2 硬度的测定

硬度测定参考曹建康等[14]的方法，在黄瓜果实头部(花萼端)、赤道部位、尾部(果梗端)取1 cm厚果肉，将硬度计垂直打入黄瓜果实果肉处测定。

1.3.3 EL、MDA含量的测定

EL的测定参考曹建康等[14]的方法进行修改。黄瓜切成薄片，用打孔器取圆片，加20 mL去离子水，振荡后过滤，再加入离子水，测定初始电导率(R0)。真空干燥后放入振荡箱振荡，测定样品溶液电导率(R)。煮沸取出后冷却，测定溶液的电导率(R′)。按照公式(2)计算电解质外渗百分率(Y)：

(2)

MDA含量采用MDA测试盒测定。

1.3.4 PPO活性的测定

参考曹建康等[14]的方法。PPO催化后形成产物在420 nm处有最大光吸收峰，可利用比色法测定。

1.3.5 可溶性蛋白含量的测定

采用紫外吸收法[14]测定。在280 nm处其吸光度值蛋白质出现吸收高峰，其吸光度值与蛋白质含量成正比。

1.3.6 CAT、POD、APX、SOD的活性测定

CAT、APX活性测定参考CHEN等[15]的方法；CAT以每克果肉1 min内OD240值变化0.01为1个酶活单位；APX以每克果肉1 min内OD290值变化0.01为1个酶活单位；POD含量参考曹建康等[14]的方法，采用愈创木酚法进行测定；超氧化物歧化酶含量的测定采用SOD测试盒测定。

1.3.7 H2O2含量和超氧阴离子自由基的测定

1.4 数据分析

所有试验数据进行3次重复，SPSS软件进行单因素方差分析，Duncan法进行多重比较，数据采用Excel 2010软件处理。

2 结果与分析

2.1 短时热处理对黄瓜果实不同部位冷害指数的影响

冷害指数是能直观地判断冷害发生程度的指标[16]。如图1所示，黄瓜在4 ℃贮藏条件下，CK组和HWT组的冷害指数随贮藏时间的延长逐渐增加。在贮藏初期，黄瓜果实冷害症状不明显，3 d后，HWT组和CK组黄瓜的头部和中部均发生冷害，靠近头部最严重，而尾部的冷害则推迟到第6天出现，之后冷害指数急剧上升，到第12天时CK组的头部和中部的冷害指数达到0.6以上，HWT组的头部和中部的冷害指数均低于对照组，HWT组尾部的冷害指数最低，仅为0.32，贮藏结束时CK组以及HWT组头部、中部和尾部的冷害指数分别达到了0.84、0.85、0.62、0.79、0.80和0.55。黄瓜果实头部、中部到尾部冷害指数逐渐上升，且存在显著差异(P<0.05)。由此可见，黄瓜不同部位抑制冷害的效果不同，实验结果表明整个低温贮藏期，热处理可以减轻贮藏过程中冷害的发生时间，且HWT组的头部和中部的冷害要高于HWT组的尾部。王静等[17]研究发现哈密瓜果实经过55 ℃热水处理3 min，推迟了冷害的发生时间，使细胞膜破坏程度减轻，与本试验结果一致。

图1 短时热处理对黄瓜果实不同部位冷害指数的影响

2.2 短时热处理对黄瓜果实不同部位硬度的影响

黄瓜果实硬度是衡量其贮藏寿命的重要指标之一。如图2所示，CK组和HWT组的硬度均呈现下降的趋势，且随着贮藏时间的延长，其降幅存在一定的差异。黄瓜果实贮藏3 d时，HWT组头部、中部和尾部的黄瓜果实硬度分别比CK组的头部、中部和尾部高1.56%、2.21%和2.34%。贮藏9 d后，HWT组的头部、中部、尾部的硬度较0 d分别低12.34%、11.32%、9.96%，对照组的头部、中部和尾部较0 d低15.79%、14.55%、10.54%。贮藏后期，随着冷害的加重，CK组黄瓜果实中部的硬度降幅逐渐升高，说明冷害程度加速硬度的下降，下降的原因可能是冷害的加深，导致细胞软化程度加深。从图2可以看出，热处理能较好地维持果实较高的硬度，且不同部位的黄瓜果实硬度存在显著差异(P<0.05)，随着贮藏时间的延长，头部和中部的下降幅度增大。HWT组黄瓜果实的头部、中部和尾部的硬度分别高于CK组头部、中部、尾部的硬度，说明不同部位的黄瓜果实在低温逆境下抑制硬度下降程度不同，而尾部的硬度比头部和中部高，说明黄瓜果实尾部能更好地抑制软化程度的加深。

图2 短时热处理对黄瓜果实不同部位硬度的影响

2.3 短时热处理对黄瓜果实不同部位电解质外渗率和丙二醛含量的影响

黄瓜果实在低温贮藏后细胞膜发生破坏，导致果实冷害的发生[18]。邵婷婷等[19]利用50 ℃强制对流热空气处理20 min能够推迟青椒果实冷害发生的时间，能有效减轻低温胁迫下活性氧的伤害，延缓了青椒果实冷害的发生。如图3所示，CK组和HWT组的电解质外渗率(EL)均呈现增加的趋势，且随着贮藏时间的增加而增加。在4 ℃下贮藏9 d后，HWT组的头部、中部、尾部的电解质外渗率分别为59.6%、56.2%、53.26%，较CK组的头部、中部和尾部低6.88%、7.62%、6.51%。说明热处理可以使黄瓜果实在低温逆境下产生抗性，进而保护细胞的膜脂状态，而尾部的电解质外渗率值比头部和中部低，说明黄瓜果实尾部的抗冷性更强。

图3 短时热处理对黄瓜果实不同部位电解质外渗率(EL)的影响

丙二醛含量的变化跟电解质外渗率一样均表征细胞膜的破坏情况，细胞膜上的磷脂分子被氧化，生成过氧化产物丙二醛称之为膜脂过氧化现象，丙二醛的累积会破坏细胞膜的完整性[20]。ENDO等[21]通过青梅果实在45 ℃水中浸泡5 min,抑制了丙二醛和过氧化氢的升高，延缓了抗坏血酸含量和总抗氧化能力水平的下降，显著降低果实对CI的敏感性。如图4所示，在第3天，MDA含量有下降的趋势，尾部下降较为明显；6 d后，各组的黄瓜MDA含量增加迅速；贮藏前9 d,CK组尾部的MDA含量低于HWT组的中部和头部，与贮藏前期冷害程度较低有关；至贮藏末期，对照组的头部MDA含量的增长率最高，HWT组的尾部增长率最小；在贮藏结束时，其数值由贮藏初期的3.45 nmol/g升至7.36 nmol/g，显著小于其他处理组(P<0.05)，说明热处理能够减轻细胞膜的破坏，从而减轻冷害，而热处理组尾部的细胞膜破坏程度最低。

图4 短时热处理对黄瓜果实不同部位丙二醛含量的影响

2.4 短时热处理对黄瓜果实不同部位可溶性蛋白含量的影响

可溶性蛋白作为果实组织中的营养物质，也是重要的渗透调节物质，对生物膜和细胞起到保护作用[22]。从图5可以看出，贮藏过程中，黄瓜果实可溶性蛋白含量呈现出先急剧上升后缓慢下降的趋势。贮藏前3 d，可溶性蛋白含量明显上升，可能与冷敏果实受到低温胁迫机体自身合成一些小分子蛋白有关，接着可溶性蛋白质含量逐渐下降，可能是与低温引起的蛋白质合成酶系统遭到破坏有关[23]。贮藏3 d后，可溶性蛋白含量逐渐下降，各组之间差异显著(P<0.05)。HWT组尾部的可溶性蛋白含量由3 d时的0.70 mg/g下降至15 d时的0.49 mg/g，下降了42.86%。HWT组尾部的可溶性蛋白含量一直高于其他处理组，这可能是因为果蔬在遭受低温逆境胁迫时，能合成小分子物质，以增强其抗逆性。

图5 短时热处理对黄瓜果实不同部位可溶性蛋白含量的影响

2.5 短时热处理对黄瓜果实不同部位多酚氧化酶活力的影响

在果蔬贮藏过程中，多酚氧化酶参与一系列由酶促活动而引起的化学变化，多酚氧化酶使酚类物质氧化，引起果实组织褐变[24]。如图6所示，贮藏过程中，PPO活力呈现上升的趋势。贮藏初期PPO的活力上升，但各组之间数值差别不大，至6 d时，多酚氧化酶活力变化出现差异，黄瓜果实的尾部增长率最高达到8.03 U/g;至9 d时，多酚氧化酶活力再次上升，CK组尾部达到13.71 U/g，上升速度快、幅度大，随着贮藏时间的延长，多酚氧化酶活力持续上升;15 d时CK组尾部比HWT组尾部高2.1(U/g)。在贮藏过程中，HWT组头部的PPO活力相对最低，而CK组尾部的PPO活力在各组中相对最高.贮藏9 d后,HWT组尾部的PPO活力高于CK组的头部和中部，与果实组织的成熟度有关，黄瓜果实尾部的成熟度大于头部和中部。

图6 短时热处理对黄瓜果实不同部位多酚氧化酶(PPO)活力的影响

2.6 短时热处理对黄瓜果实不同部位CAT、POD和APX、SOD酶活力的影响

在反应过程中，CAT能催化H2O2形成H2O[25]，能够有效地清除自由基，从而维持膜的稳定性，减轻机体不良反应,如图7所示。

图7 短时热处理对黄瓜果实不同部位过氧化氢酶(CAT)活力的影响

CAT酶活力呈现出先增大后减小的趋势，贮藏第9天时各处理组的CAT活力均达到峰值，随后逐渐降低。HWT组的头部和中部的CAT活力大于CK组的头部和中部;CK组的头、中、尾部较0 d的高1.74倍、2.05倍和2.27倍，HWT组的头、中、尾部较0 d的高1.92倍、2.22倍和2.46倍，表明果实中CAT活力在热处理时被诱导升高，经过热处理后黄瓜果实的活性氧较低，清除部分活性氧，细胞受伤害程度减小，从而抑制了冷害的发生，而且HWT组和CK组尾部的CAT活力都较高，说明尾部的CAT活力对于催化植物体内的H2O2分解为水和氧分子，从而减少H2O2对果蔬组织可能造成的氧化伤害的作用更显著。

图8 短时热处理对黄瓜果实不同部位过氧化物酶(POD)活力的影响

抗坏血酸过氧化物酶(APX)能催化抗坏血酸与H2O2发生反应，清除果实内H2O2，进而提高果蔬的抗氧化能力[27]。如图9所示，随贮藏时间的延长，各处理组的APX活力均呈现先上升后下降的趋势；HWT组的APX活力在贮藏第6天达到最大值，头、中、尾部的值分别为111.13、112.88、123.25 U/g，比0 d高3.72、3.76、和4.9倍，随后迅速下降。CK组APX活力在贮藏第9天达到最大值，头、中、尾部的值为87.88、88.38、91.13 U/g。上述结果表明，热处理可以保持细胞较高的活性氧清除酶活力，从而减少活性氧的积累，且HWT组尾部的活性氧清除酶活力最高。

图9 短时热处理对黄瓜果实不同部位抗坏血酸过氧化物酶(APX)活力的影响

超氧化物歧化酶(SOD)可催化超氧阴离子自由基歧化生成H2O2和O2，前者分解为无毒的H2O和O2，也能够保护细胞膜的完整性[28]。如图10所示，随贮藏时间的延长，各处理组的SOD活力均呈现先上升后下降的趋势,HWT组的增长趋势明显。在贮藏第3天，SOD活力增长差别较小，HWT组的头部、中部小于CK组的尾部，是由于贮藏前期冷害不明显，尾部的抗冷性更强；各组SOD活力在贮藏第6天达到峰值，HWT组头、中、尾部的值分别比CK组高36.37%、34.05%、30.76%。上述结果表明，热处理可以有效提高果实的SOD酶活力，增强了清除自由基的能力；HWT组的尾部增长率高，说明尾部的自我保护能力更高。

图10 短时热处理对黄瓜果实不同部位超氧化物歧化酶(SOD)活力的影响

2.7 短时热处理对黄瓜果实不同部位H2O2含量和超氧阴离子自由基的影响

H2O2是植物体内一种活性氧自由基，当活性氧清除系统代谢不平衡时，H2O2将会大量累积导致细胞膜结构受到破坏。由图11可知，在贮藏期间(黄瓜H2O2含量总体呈上升的趋势)，可对黄瓜果实细胞组织造成损伤。在贮藏初期，各组H2O2含量的头部和中部无显著性差异。在贮藏后期，CK组的H2O2含量显著大于HWT组，第12天，CK组头部、中部和尾部的H2O2含量分别比HWT组的头部、中部和尾部高出26.7%、35.6%及38.1%。贮藏15 d，果实CK组头部、中部、尾部的H2O2含量比0 d高4.8、4.7和4.6倍；HWT组头部、中部和尾部的黄瓜果实的H2O2含量比0 d高3.9、3.8和3.7倍，表明热处理在贮藏期能明显抑制黄瓜果实体内H2O2含量上升，尾部的抑制效果更明显。

图11 短时热处理对黄瓜果实不同部位H2O2含量的影响

图12 短时热处理对黄瓜果实不同部位的影响

3 结论

热水处理能抑制黄瓜果实丙二醛含量以及电解质外渗率的升高，能提高APX、CAT、POD活力，提高黄瓜果实的抗氧化能力和活性氧清除能力。赵宇瑛等[34]为了研究黄瓜果实采后的耐冷性,在2 ℃下贮藏9 d后,分别测定头部(花萼端)、中部、尾部(果梗端)3个部位的指标，黄瓜果实从尾部到头部的耐低温能力逐渐降低。本试验热处理组的头、中、尾部与对照组相比，冷害指数、电导率、MDA含量要低于对照组，热处理组的头、中、尾部硬度分别高于对照组的头、中、尾部，POD、CAT活力要高于对照组，这说明黄瓜果实不同部位热处理均减轻了冷害带来的影响,提高其抗冷性。且黄瓜果实尾部的冷害指数一直低于其他处理组，黄瓜头部、中部、尾部的抗冷性存在差异,这种差异与POD和CAT的活性以及渗透作用存在密切的联系。各处理组对黄瓜冷害抑制的程度为热处理组>对照组，尾部>中部>头部。