高产橙黄色素低产桔霉素红曲菌的液态发酵条件优化

周珂，严鹏程，胡永丹*

1(昆明理工大学 农业与食品学院，云南 昆明，650500) 2(昆明理工大学 云南省食品安全研究院，云南 昆明,650500)

红曲色素是红曲菌代谢过程中形成的聚酮类化合物[1]，主要有黄、橙、红3种色调[2]，具有抗氧化[3]、抗肥胖[4]、增强免疫力、调节血脂[5]以及抑制阿尔茨海默病[6]的功效，在食品、酿酒、保健品等行业均有广泛应用。其中红色素的生产工艺已十分成熟，而橙、黄色素因其良好的感官性能，来源天然以及不受季节、地域性限制等优点，具有良好的发展潜力和经济潜能，因此成为天然色素产品开发的新方向。

然而在红曲菌的发酵过程中，桔霉素常常伴随红曲色素的合成而产生。桔霉素有损害肝脏代谢、致畸[7]、致癌和致突变的作用[8]，并可能对中枢神经系统产生抑制[9]，这使得红曲产品的食用安全性受到挑战，限制了它的应用。目前，降低桔霉素含量主要是通过筛选菌株、基因工程及控制发酵条件3种方法[10]。已有学者通过菌株筛选获得了低产桔霉素的红曲菌株[11]。此外，通过优化发酵条件也能够控制红曲的生长情况[12]，以及利用低频磁场能够抑制桔霉素的产生[13]。本研究通过改变红曲菌液态发酵条件(如培养基成分、培养条件)，研究红曲色素和桔霉素在红曲菌中的积累规律[14]，通过外部调控选择安全有效的培养方式，为红曲色素的安全应用提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株

红曲菌株(MonascuspurpureusZH2)，由江南大学固态发酵研究室提供。

1.1.2 试剂

葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉、蔗糖、(NH4)2SO4、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、MnSO4,国药集团化学试剂有限公司；玉米浆干粉、酵母膏,南京茂捷微生物科技有限公司；马铃薯、大米粉、糯米粉,市售；桔霉素(标准品),上海源叶生物科技有限公司产品；甲醇、磷酸,天津风船化学试剂科技有限公司；乙腈,上海星可高纯溶剂有限公司。

1.1.3 主要仪器设备

RXZ-288A人工气候箱，宁波江南仪器厂；LS-30立式压力蒸汽灭菌器，上海东亚压力容器制造有限公司；QYC-2102全温培养摇床，宁波市科技园区新江南仪器有限公司；T9CS双光束紫外可见光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；1260高效液相色谱仪,安捷伦科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基与培养条件

将红曲菌接种于PDA斜面，放置于28 ℃恒温培养箱中静置培养7 d，4 ℃保藏。

制备孢子悬浮液：用无菌水洗下PDA斜面上的红曲菌孢子，然后用玻璃珠将菌团打散后过滤，血球计数板计数，使孢子数达到1×(107～108)个/mL。

种子培养基(g/L)：葡萄糖60，大豆水解液60，蛋白胨10，NaNO31.0，MgSO4·7H2O 2.0，KH2PO45.0，ZnSO40.02，pH自然。在28 ℃、180 r/min的条件下培养48 h。

初始发酵培养基(g/L)：葡萄糖60，蛋白胨10，NaNO33.0，初始pH自然。

所有培养基均在121 ℃下灭菌20 min。

1.2.2 实验方法

1.2.2.1 不同碳源对红曲菌生长的影响

采用葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉、蔗糖、大米粉、糯米粉，分别设置40、50、60 g/L三个梯度，氮源统一为蛋白胨，无机盐为KH2PO4和K2HPO4，pH自然。250 mL三角瓶装液50 mL，经121 ℃灭菌20 min，接种10%种子培养基，每组样品做3个平行，在28 ℃，180 r/min下振荡培养5 d。

1.2.2.2 不同氮源对红曲菌生长的影响

可溶性淀粉作为碳源，添加量为60 g/L，(NH4)2SO4、NH4Cl、蛋白胨、玉米浆干粉、酵母膏、NaNO3为氮源，分别设置10、20、30 g/L 3个梯度，无机盐及培养条件同上。

1.2.2.3 不同无机盐对红曲菌生长的影响

可溶性淀粉添加量为60 g/L，(NH4)2SO4添加量为10 g/L，向发酵培养基中分别添加KH2PO4、K2HPO4、MgSO4(1.0、2.0、3.0 g /L)、ZnSO4(0.05、0.1、0.15 g/L)、MnSO4(0.1、0.2、0.3 g /L)。培养条件同上。

1.2.2.4 复合添加无机盐对红曲菌生长的影响

以添加K2HPO4的发酵培养基为对照，在此基础上分别将MgSO4、MnSO4、ZnSO4设计成不同的添加组合，各种无机盐的添加量与1.2.2.3优化出的单因素添加量一致。培养条件同上。

1.2.2.5 不同温度对红曲菌生长的影响

可溶性淀粉添加量为60 g/L，(NH4)2SO4添加量为10 g/L，K2HPO4添加量为2 g/L，接种量为8%，将接种好的摇瓶分别放置在18、23、28、33 ℃的条件下培养5 d。

1.2.2.6 不同装液量对红曲菌生长的影响

可溶性淀粉添加量为60 g/L，(NH4)2SO4添加量为10 g/L，K2HPO4添加量为2 g/L，接种量为8%，分别向250 mL锥形瓶中添加50、60、70、80、90、100、110、120 mL发酵培养基，在28 ℃条件下培养5 d。

1.2.2.7 不同pH对红曲菌生长的影响

可溶性淀粉添加量为60 g/L，(NH4)2SO4添加量为10 g/L，K2HPO4添加量为2 g/L，接种量为8%，装液量为50 mL/250 mL，初始pH用HCl和NaOH调至2、3、4、5、6、7、8，在28 ℃条件下培养5 d。

1.2.2.8 不同转速对红曲菌生长的影响

可溶性淀粉添加量为60 g/L，(NH4)2SO4添加量为10 g/L，K2HPO4添加量为2 g/L，接种量为8%，装液量为50 mL/250 mL，初始pH为3，将摇床转速分别设置为160、180、200、220 r/min，在28 ℃条件下培养5 d。

1.3 测定方法

1.3.1 测定色价

将发酵液研磨破碎后取1 mL于25 mL比色管中，用体积分数为70%的乙醇定容至25 mL，颠倒混匀，置于60 ℃恒温水浴中浸提40 min。浸提结束后，取出冷却至室温，用乙醇稀释适当倍数，并以70%乙醇为空白对照，在全波长扫描下找出橙、黄色素的最大吸收峰，得到黄、橙色素的OD值。通过公式(1)、(2)计算色价：

黄色价/(U·mL-1)=OD410×总稀释倍数

(1)

橙色价/(U·mL-1)=OD470×总稀释倍数

(2)

1.3.2 测定菌体干重

将滤纸烘干至恒重，精确称量滤纸的质量。充分混合后精确量取30 mL发酵液进行抽滤，滤渣用蒸馏水充分洗涤数遍后，55 ℃烘干至恒重，精确称量滤渣及滤纸的总质量。

1.3.3 桔霉素含量测定

将发酵液经破碎后取5 mL置于15 mL比色管中，并用同体积的甲醇定容至10 mL，超声萃取30 min后于8 000 r/min下离心10 min，然后将提取液微滤后用HPLC分析检测桔霉素含量。

HPLC色谱条件：流动相，V(0.1%磷酸水)∶V(乙腈)=66∶34；VWD检测器λ=330 nm；色谱柱5 μm，Agilent XDB Reversed-phase C18；柱长及柱径250 mm×4.6 mm；体积流量1.0 mL/min；温度30 ℃；标准样及样品进样量均为20 μL。

1.4 数据统计分析

显著性差异分析使用非参数秩和检验的方法(IBM SPSS Statistics 20，NY，USA)。数据作图使用Origin 8.5(Originlab corporation，Inc.MA，USA)。

2 结果与分析

2.1 300～600 nm内的波长扫描

按照1.3.1方法对发酵提取液进行可见光波长范围内扫描，确定橙、黄色素所在的波长范围，结果如图1所示。可以看出，在410 nm和470 nm附近有明显的吸收峰，分别为黄色素和橙色素。

图1 红曲菌液态发酵色素提取液的光谱扫描图

2.2 碳源对红曲菌生长的影响

由表1可知，葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉促进红曲菌ZH2色素生长的效果相对明显。可溶性淀粉作为碳源时，红曲菌在代谢过程中产生淀粉酶和糖化酶将淀粉缓慢分解，从而使发酵液中的单糖浓度维持在一定水平，不会造成菌体快速地大量生长，有利于红曲色素的产生和积累。而高浓度的葡萄糖作为碳源时，会产生乙醇，从而抑制菌体的生长和色素的合成[15]。当蔗糖作为碳源时，菌体成大块团状，与培养基接触面积过小，导致菌体缺乏营养，不利于色素的积累。麦芽糖和葡萄糖为碳源时，桔霉素质量浓度最高达到7.15、8.35 μg/mL，可溶性淀粉质量浓度为60 g/L时，桔霉素含量最低，为5.91 μg/mL，所以选择60 g/L可溶性淀粉为红曲菌ZH2发酵的碳源。

2.3 氮源对红曲菌生长的影响

以60 g/L可溶性淀粉作为碳源，分析氮源对红曲菌生长的影响。由表2可知，不同种类及浓度的氮源对红曲菌ZH2的橙黄色素产量、菌丝干重、桔霉素的含量影响差异较大，表现出无机氮源整体优于有机氮源。(NH4)2SO4等无机氮源更适合橙黄色素生长，这可能是因为铵盐作为氮源被消耗时，降低了发酵液pH值，使发酵体系处于酸性环境中，影响相关代谢酶活性，抑制桔霉素生成或加速其作为中间代谢产物的分解，促进红曲黄色素生物合成[16]。

表1 不同碳源对红曲菌ZH2生长的影响

注：大写字母、小写a、a1、a2等字母分别代表各种类间黄色价、橙色价、菌丝干重、桔霉素含量的显著性差异(P<0.05)(下同)

表2 不同氮源对红曲菌ZH2生长的影响

当有机氮源作为红曲菌的氮源时，会被红曲菌在代谢过程中产生的蛋白酶分解成多种氨基酸，从而与红曲橙色素发生反应，将橙色素转变成水溶性红色素。而无机氮源中不含氨基酸类物质，所以不会出现上述现象。当(NH4)2SO4质量浓度为10 g/L时，黄色素含量最高，菌体生长状况良好，且桔霉素含量为7.011 μg/mL，处于较低水平。结合显著性差异分析，选择(NH4)2SO410 g/L作为红曲菌ZH2发酵的最佳氮源及添加量。通过氮源的优化选择，发酵液由之前的棕红色变成了明显的橙黄色。

2.4 外加无机盐对红曲菌生长的影响

以可溶性淀粉及(NH4)2SO4作为发酵培养基的碳、氮源，添加不同的无机盐到发酵培养基中，产生的色素色价各有不同，其中 KH2PO4和K2HPO4比其他几种无机盐发酵产生的橙、黄色素优势明显，这是因为KH2PO4和K2HPO4能够作为培养基的缓冲体系，维持并稳定培养基在红曲菌代谢过程中的pH。由表3可知，添加K2HPO4比KH2PO4产生的桔霉素含量要少，在质量浓度为2.0 g/L时，橙、黄色价分别达到113.51 U/mL，79.63 U/mL，桔霉素含量为6.82 μg/mL。从原材料的来源及贮存等方面考虑，选用K2HPO4为红曲菌ZH2发酵的无机盐。

磷酸盐在微生物生长和代谢调节中，具有重要的生理功能，但在合成产物的过程中还需要一些无机离子的参与[17]。以添加K2HPO4的发酵培养基为对照，在此基础上分别添加MgSO4、MnSO4、ZnSO4、MnSO4+ZnSO4、MgSO4+ZnSO4、MgSO4+MnSO4、MgSO4+MnSO4+ZnSO4等不同无机盐组合，考察复合无机盐对红曲生长的影响。由表3可知，添加了2 g/L的MgSO4和0.02 g/L的ZnSO4组合生产色素的能力最高，橙、黄色素色价分别达到119.28 U/mL，94.38 U/mL，相对应的桔霉素含量为7.10 μg/mL。综上所述，将2.0 g/L K2HPO4、2.0 g/L MgSO4及0.02 g/L ZnSO4作为红曲菌ZH2的外加无机盐。

表3 不同无机盐对红曲菌ZH2生长的影响

注：后7组中无机盐的添加量(g/L)分别为MgSO42；MnSO40.04；ZnSO40.02；MnSO40.04+ZnSO40.02；MgSO42+ZnSO40.02；MgSO42+MnSO40.04；MgSO42+MnSO40.04+ZnSO40.02

2.5 温度对红曲菌生长的影响

由图2可知，在18～28 ℃的温度范围下，随着温度升高，橙、黄色素色价升高。当培养温度为28 ℃时，发酵液的色价最大，橙、黄色素色价分别为59.06 U/mL，38.56 U/mL；温度超过30 ℃，发酵液的色价明显降低，原因可能是因为温度对微生物细胞生长、产物合成及代谢的影响是多方面的，不仅可以改变培养基的性质，而且会影响细胞代谢过程中各种关键酶的活性[18]。过高或过低的温度，不利于菌体的生长和色素的积累，从桔霉素含量可以看出，在28 ℃下桔霉素含量最低，达到5.70 μg/mL，故选择28 ℃为培养的最适温度。

图2 温度对红曲菌生长的影响

2.6 装液量对红曲菌生长的影响

从图3可以看出，随着装液量的增加，橙、黄色素产量逐渐降低，菌丝干重逐渐减少，说明装液量越大，越不利于红曲菌的生长[19]。这是因为红曲菌是好氧菌，在营养充足的情况下，装液量越少其通气量越大，溶氧量越多，有利于菌体生长以及产生色素等代谢产物。同时装液量不同，桔霉素的含量差别较大，在50～100 mL时，桔霉素逐渐增加，直到装液量为110 mL时，桔霉素含量随有所降低，但仍高于50 mL时的桔霉素含量。装液量为50 mL时，橙、黄色素分别达到85.50 U/mL，83.63 U/mL，菌丝干重更多，说明该条件下更有利于菌体的生长，对应的桔霉素含量最低，仅为5.73 μg/mL，故选择50 mL为最佳装液量。

2.7 不同pH对红曲菌生长的影响

由图4可知，中性环境促进红曲菌产色素的能力不够突出；中性偏酸环境有利于红曲菌产色素，菌体得率也较高，过酸环境既不利于菌体的生长也不利于色素的生成；在碱性环境下菌体基本不生长，色价也很低[20]。综上，过酸或碱性环境都不利于色素的生长积累，当pH 3～4时，菌体生长良好，总色价较高，发酵液颜色较深，其中pH 3的效果最好，红曲菌产色素的最适pH应该最接近3[21]。pH为3时，橙、黄色素含量分别达到75.63 U/mL，107.00 U/mL，而且其相对应的桔霉素含量为6.43 μg/mL，低于产色素能力相近的pH 4所对应的桔霉素含量8.27 μg/mL，所以选择pH 3作为红曲菌ZH2发酵的初始pH。

图4 不同pH对红曲菌ZH2产红曲色素的影响

2.8 不同转速对红曲菌生长的影响

由图5可知，随着转速的增加，橙、黄色素色价逐渐增大，在200～220 r/min时达到稳定状态。转速越大，通气量越大，红曲菌的溶氧就越大，从而越有利于菌体生长，但是转速过大，虽能增加溶氧量，但会因剪切力过大，对菌丝的生长产生影响，从而导致色素的生长能力降低[19]。由图5看出，在200 r/min和220 r/min条件下的色素产量相当，但后者的菌体生长量达到最大，且桔霉素含量低于200 r/min时，所以选择220 r/min作为培养的最佳转速。在此条件下，红曲菌ZH2的橙、黄色素色价分别达到152.96、108.38 U/mL，桔霉素含量为5.80 μg/mL。

图5 不同转速对红曲菌ZH2生长的影响

3 结论

通过对红曲菌ZH2进行单因素优化实验，得到了在摇床水平下发酵红曲菌ZH2高产红曲色素、低产桔霉素的最佳培养基配方：碳源为可溶性淀粉60 g/L，氮源为(NH4)2SO410 g/L，无机盐K2PO42.0 g/L，MgSO42.0 g/L，ZnSO40.02 g/L；最适的发酵条件为温度28 ℃，装液量50 mL/250 mL，初始pH 3，转速220 r/min，发酵5 d。经过优化后，发酵液中橙、黄色素由最初的18.59 U/mL，24.54 U/mL分别提高到152.96 U/mL，108.38 U/mL，桔霉素含量由最初的8.35 μg/mL减少到5.80 μg/mL，降低了30%。