硝呋齐特对A549细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响及其作用机制

李亚 李春梅

肺腺癌是临床常见恶性肿瘤之一，临床常采用化疗等方法治疗肺腺癌，但肺腺癌细胞耐药性的产生导致患者预后差[1-3]。因而寻找新型治疗方法对提高肺腺癌患者生存率及改善患者预后均具有重要意义。硝呋齐特(nifuroxazide)属于硝基呋喃类抗生素，研究表明硝呋齐特具有抗炎、抗感染等作用[4]。相关报道指出硝呋齐特具有抗肿瘤作用，并可抑制肝癌等肿瘤细胞增殖及转移[5]。但硝呋齐特在肺腺癌中的作用尚未可知。微小RNA(microRNA，miRNA)可调控基因转录后水平及翻译水平从而调控细胞生长、发育等过程，研究表明微小RNA-219-5p(microRNA-219-5p，miR-219-5p)在肺腺癌等多种恶性肿瘤中表达下调并可参与肿瘤发生发展过程[6-7]。本研究主要探讨硝呋齐特对肺腺癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响，并探究其是否通过调控miR-219-5p表达而发挥作用，以期为临床合理应用硝呋齐特提供理论依据。

资料与方法

一、材料与试剂

硝呋齐特购自湖北猫尔沃生物医药有限公司；肺腺癌A549细胞购自美国ATCC公司；DMEM培养基、胎牛血清与0.25%胰蛋白酶均购自美国Gibco公司；miR-219-5p抑制剂(anti-miR-219-5p)及其阴性对照(anti-miR-con)购自广州锐博生物科技有限公司；二 喹 啉 甲 酸 (bicinchoninicacid，BCA)蛋白定量检测试剂盒与蛋白裂解液均购自美国Pierce公司；Lipofectamine2000与Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；Transwell小室购自美国Corning公司；Matrigel基质胶购自美国BD公司；兔抗人B淋巴细胞瘤-2 ( Bcl-2)、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白( Bax)单克隆抗体购自美国Abcam公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗购自武汉博士德生物工程有限公司；甲基噻唑基四唑( methylthiazolyl tetrazolium，MTT)购自北京索莱宝科技有限公司；膜联蛋白V(Annexin V)-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶( Propidium Iodide，PI) 细胞凋亡试剂盒购自上海研谨生物科技有限公司。

二、方法

1 实验处理与分组 肺腺癌A549细胞培养于DMEM培养基(含10%胎牛血清与青霉素-链霉素混合溶液)，置于37℃、5%CO2培养箱内培养，收集对数生长期A549细胞，用不同浓度(2.5、5、10 μmol/L)的硝呋齐特处理细胞，分别命名为2.5 μmol/L nifuroxazide组、5 μmol/L nifuroxazide组、10 μmol/L nifuroxazide组，未经任何处理的细胞作为Control组[8]，各组细胞处理时间为48 h，MTT实验筛选适宜作用浓度用于后续研究。A549细胞中分别转染anti-miR-219-5p、anti-miR-con，随后用浓度为10 μmol/L的硝呋齐特处理48 h，分别命名为nifuroxazide+anti-miR-219-5p组、nifuroxazide +anti-miR-con组。

2 MTT检测细胞增殖 取对数生长期A549细胞，0.25%胰蛋白酶消化细胞，加入DMEM培养液制备单细胞悬液，调整细胞密度为3×104个/mL，按照每孔3×103个细胞的密度接种于96孔板，按照“1.2.1”分组处理，每孔加入20 μL MTT溶液(浓度5 mg/mL)，37℃、5%CO2培养箱内继续培养4 h，每孔加入150 μL二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)，低速振荡10 min，应用SpectraMaxM5酶标仪检测波长490 nm时各孔吸光度值(A值)。

3 流式细胞术检测细胞凋亡 取对数生长期A549细胞，0.25%胰蛋白酶消化细胞，调整细胞密度，按照每孔1×106/mL的密度接种于6孔板，待细胞生长至80%左右，按照“1.2.1”分组进行处理，置于37℃、5%CO2培养箱内继续培养48 h，收集细胞，预冷PBS洗涤2次，依次加入5 μL Annexin V-FITC与5 μL PI，室温避光孵育10 min，应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

4 Transwell实验检测细胞迁移与侵袭 细胞迁移实验：取各组对数生长期A549细胞，胰蛋白酶消化后加入不含血清的DMEM培养液制备单细胞悬液(5×104个/mL)，接种于Transwell小室的上室(200 μL/孔)，Transwell小室的下室加入含有10%胎牛血清的培养液(600 μL)，置于37℃、体积分数5%CO2培养箱内培养24 h，弃上清液，PBS洗涤，多聚甲醛固定10 min，PBS洗涤，0.1%结晶紫染液染色10 min，用棉签擦掉未迁移细胞，显微镜下随机选取5个视野观察迁移细胞数。细胞侵袭实验：用预冷培养液稀释Matrigel基质胶(9:1)，Matrigel稀释液平铺于Transwell小室上室(40 μL/孔)，置于37℃、体积分数5%CO2培养箱孵育5 h，其余步骤同细胞迁移实验。

5 实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)检测细胞中miR-219-5p表达水平 采用Trizol法提取细胞总RNA，参照反转录试剂盒合成cDNA，miR-219-5p正向引物5′-ACACTCCAGCTGGGTGATTGTCCAACGC-3′，反向引物：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；U6正向引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。以cDNA为模板进行qRT-PCR反应，参照试剂盒配置反应体系：SYBR Green Master Mix 10μL/孔，正反向引物0.8 μL/孔，cDNA 1 μL/孔，ddH2O补足体系至20 μL；反应条件：95℃ 2 min(循环1次)，95℃ 30 s，60℃30 s，72℃ 30 s(循环35次)。miR-219-5p以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-219-5p相对表达量。

6 蛋白免疫印迹(Western blot)检测Bax、Bcl2蛋白表达 收集各组A549细胞，加入适量蛋白裂解液，裂解30 min(冰上)，提取细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)电泳分离蛋白，每孔加样30 μg(变性蛋白)，分离的蛋白凝胶转移至PVDF膜，室温条件下采用5%脱脂牛奶封闭2 h，加入一抗(1 ∶1000)4℃孵育24 h，TBST洗涤，分别加入相应二抗(1 ∶2000)，室温孵育1 h，TBST洗涤，加入ECL化学发光剂，曝光显影，应用ImageJ软件分析各条带灰度值。

三、统计学处理

结 果

一、硝呋齐特对肺腺癌细胞A549活力的影响

与Control组相比，5μmol/L nifuroxazide组、10μmol/L nifuroxazide组肺腺癌A549细胞活力显著降低(P<0.05)，由于硝呋齐特使用剂量10 μmol/L时细胞活力相对较低，因而选用10 μmol/L硝呋齐特进行后续研究(见表1)。

表1 硝呋齐特对A549细胞活力的影响

注：nifuroxazide：硝呋齐特；与control组比较，*P<0.05

二、硝呋齐特对A549细胞凋亡的影响

与Control组相比，nifuroxazide组A549细胞凋亡率显著增加(P<0.05)，Bax蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，Bcl2蛋白表达水平显著降低(P<0.05)(见图1、2、表2)。

图1 硝呋齐特对A549细胞凋亡的影响

图2 Western blot检测硝呋齐特对A549细胞凋亡相关蛋白表达的影响

三、硝呋齐特对A549细胞迁移、侵袭的影响

实验结果显示，相对于Control组，nifuroxazide组A549细胞迁移与侵袭数均显著减少(P<0.05)(见图3、表3)。

表2 硝呋齐特对A549细胞凋亡的影响

注：与control组比较，*P<0.05

表3 硝呋齐特对A549细胞迁移、侵袭的影响

注：与Control组比较，*P<0.05

图3 硝呋齐特对A549细胞迁移、侵袭的影响

四、硝呋齐特对A549细胞中miR-219-5p表达的影响及anti-miR-219-5p的转染效果

与Control组比较，nifuroxazide组A549细胞中miR-219-5p表达水平显著升高；相较于nifuroxazide +anti-miR-con组，nifuroxazide+anti-miR-219-5p组A549细胞中miR-219-5p表达水平显著降低(见表4)。

五、抑制miR-219-5p的表达逆转硝呋齐特对A549细胞的抑制作用

与nifuroxazide +anti-miR-con组相比，nifuroxazide+anti-miR-219-5p组A549细胞活力显著增强(P<0.05)，细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，迁移与侵袭细胞数显著增加(P<0.05)，Bax蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，Bcl2蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。(见图4、表5)。

表4 硝呋齐特对A549细胞中miR-219-5p表达的影响及anti-miR-219-5p的转染效果

注：与control组比较，*P<0.05；与nifuroxazide +anti-miR-con组比较，#P<0.05

图4 Western blot检测A549细胞中凋亡相关蛋白的表达量

讨 论

肺腺癌的主要病理类型是非小细胞肺腺癌，目前临床现有医疗水平可提高肺腺癌患者生存率，但治疗效果具有一定局限性，晚期肺腺癌患者5年生存率较低[9-10]。肺腺癌细胞呈侵袭性生长，增加患者死亡率，细胞恶性增殖可促进肿瘤恶性进展[11]。因而寻找高效低毒性抗肺腺癌药物具有重要意义。

表5 抑制miR-219-5p的表达逆转硝呋齐特对A549细胞的抑制作用

注：与nifuroxazide +anti-miR-con组比较，#P<0.05

硝呋齐特可诱导乳腺癌细胞凋亡[12]。硝呋齐特还可诱导骨肉瘤细胞凋亡，还能够抑制骨肉瘤细胞迁移及侵袭[13]。研究表明硝呋齐特可通过调控Stat3信号通路从而抑制结直肠癌细胞转移[14]。本研究结果显示硝呋齐特处理肺腺癌细胞后，细胞增殖活力显著降低，迁移与侵袭能力明显受到抑制，细胞凋亡率显著升高，说明硝呋齐特可降低肺腺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力，并诱导细胞凋亡。研究表明Bax可通过激活线粒体途径激活细胞凋亡执行因子Caspase-3从而促进细胞凋亡，Bcl2可抑制细胞凋亡[15]。本研究结果显示硝呋齐特可显著促进肺腺癌细胞中Bax的表达而抑制Bcl2的表达，提示硝呋齐特可通过调控Bax、Bcl2表达从而诱导细胞凋亡。

miR-219-5p在胰腺癌细胞中表达下调，上调miR-219-5p表达可抑制细胞增殖及侵袭并促进细胞凋亡[16]。研究表明miR-219-5p可通过抑制HMGA2表达从而抑制卵巢癌细胞增殖及转移[17]。相关研究报道指出miR-219-5p可通过抑制BCL-2表达从而抑制恶性黑素瘤细胞增殖及转移[18]。本研究结果显示硝呋齐特可明显促进肺腺癌细胞中miR-219-5p的表达，抑制miR-219-5p表达可部分逆转硝呋齐特对肺腺癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的作用。提示硝呋齐特可通过上调miR-219-5p的表达而抑制肺腺癌细胞增殖、迁移及侵袭，促进细胞凋亡。

综上所述，硝呋齐特可通过上调miR-219-5p的表达而降低肺腺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力，诱导细胞凋亡，硝呋齐特可能成为治疗肺腺癌的一种有研究前景的药物。但关于硝呋齐特对相关信号通路的调控作用及其对miR-219-5p下游靶基因表达的影响均需深入研究。