大黄素对急性有机磷农药中毒致肺损伤大鼠肺组织Nrf-2/ARE信号通路的影响

李华 徐鹏 王黎

急性有机磷农药中毒(acute organophosphorus pesticide poisoning，AOPP)占农药中毒80%以上，其造成的呼吸衰竭是致死的重要因素[1]。AOPP患者临床救治手段包括洗胃、阿托品和胆碱酯酶复能剂等[2]，然而上述治疗后患者仍可出现急性肺损伤表现，导致治疗较为棘手。AOPP引起急性肺损伤的机制尚不完全清楚，有研究指出毒性氧自由基在有机磷中毒致肺损伤中起重要作用[3]。Nrf-2/ARE信号通路在多种氧化应激性疾病中发挥关键作用，该信号通路活化能诱导下游多种抗氧化酶形成，从而对抗ROS引发的氧化应激反应，发挥细胞保护作用[4]。因此，对AOPP所致的急性肺损伤，对Nrf-2/ARE信号通路进行调控，或许是一种行之有效的手段。大黄素为中药大黄的主要有效单体，是一种蒽醌类衍生物，近年来研究发现大黄素尚具有抗氧化应激、保护肺泡上皮的作用[5-7]。本研究通过灌喂氧乐果建立大鼠AOPP致急性肺损伤模型，检测肺组织Nrf-2，HO-1及氧化应激相关指标水平的的表达情况，并探讨大黄素对急性肺损伤的保护作用及机制，现报告如下。

资料与方法

一、实验动物

健康雄性SD大鼠54只，体质量200～240g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK(京)2018-0023。

二、主要试剂与仪器

40%氧乐果(天津中化生物科技有限公司)，生理盐水(山东华鲁制药有限公司)，大黄素(上海金穗生物科技有限公司)，水合氯醛(上海信裕生物科技有限公司)，兔抗鼠Nrf-2多克隆抗体(美国SANTA CRUZ公司)，兔抗鼠HO-1多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)，辣根过氧化物酶(HRP)结合的二抗(武汉博士德生物工程有限公司)，MDA、SOD、GSH-Px检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。倒置显微镜(Olympus公司)，全自动酶标免疫分析仪(Biotex公司)，蛋白电泳及转膜仪(美国Bio-Rad公司)。

三、大鼠模型制备及分组

将所有54只大鼠于实验室环境下给予适应性喂养后，随机选取18只作为健康对照组，正常喂养，剩余36只大鼠用于建立有机磷农药中毒急性肺损伤模型。模型建立方式[8]：AOPP组和大黄素组采用40%氧乐果20 mg/kg灌喂，建立有机磷农药中毒急性肺损伤模型，健康对照组给予等量生理盐水灌喂。大黄素组给予氧乐果灌喂后30min，经胃灌入0.4 mg/kg大黄素(以1 mL生理盐水溶解)。AOPP模型组及健康对照组大鼠均同时予以等体积生理盐水。

四、样本采集及处理

每组大鼠给药后分三批(6、24、72 h)处死，每个时间点取6只大鼠，以10%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射将大鼠麻醉后固定，放血处死后严格无菌开胸取肺组织，留取右上肺组织，用生理盐水冲洗表面血液并吸取表面水分，放入10%甲醛固定液中，常规包埋、切片，进行HE染色后镜检及读片，取左肺组织置于-80℃冰箱冻存待检。

五、大鼠肺湿/干质量测定

取各时间点处死的大鼠肺组织，称量其湿质量(W)后，置烤箱中于70℃条件下烘烤24 h至恒重，称量并记录干质量(D)，计算肺组织湿干质量比(W/D)。

六、大鼠肺组织MDA，SOD、GSH-Px检测

制备肺组织匀浆，离心后取上清液，使用比色法检测肺组织中丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性，操作严格按照试剂盒说明进行。

七、Western Blot检测肺组织Nrf-2，HO-1蛋白表达

取左肺下叶肺组织，加入组织裂解液，匀浆，提取蛋白，采用BCA法对提取蛋白质进行定量。取50μg样品蛋白经过聚丙烯酰胺凝胶电泳转印至硝酸纤维素膜，使用5%脱脂牛奶室温封闭2h后，分别加入Nrf-2，HO-1一抗和抗GAPDH抗体，4℃下孵育过夜，Tris-HCl缓冲液洗涤后加二抗室温下孵育2h。使用ECL显影剂显影，采用Image J软件进行灰度分析。计算Nrf-2，HO-1蛋白相对表达量。

八、统计学处理

结 果

一、各组大鼠行为表现

实验大鼠在氧乐果染毒后10min内表现出中毒反应，出现四肢及全身肌肉震颤表现，并有进行性加重趋势，同时有流涎、流泪症状、呼吸急促等表现，严重者出现肌无力或痉挛症状，部分有呕意。大黄素干预组在染毒初若干小时内与AOPP组具有类似的中毒表现，但在24 h后较AOPP组有明显好转，较先恢复活动，同时进食、进水行为均较好。所有氧乐果染毒大鼠在实验观察期内无一死亡。

二、大鼠肺组织病理形态观察

HE染色下可见健康对照组大鼠肺组织结构清晰，肺泡及间质无明显充血、渗出及炎症细胞浸润，具有完整的肺泡壁完整。AOPP组肺泡壁结构被破坏，部分表现为不完整状，同时伴有毛细血管充血，肺泡隔和泡腔内出血及较多炎性细胞浸润。大黄素组24、72 h时肺泡隔和泡腔内出血较AOPP组明显减轻，炎性细胞浸润减少，肺泡结构基本完整(见图1)。

三、大鼠肺组织湿干质量比(W/D)变化

与健康对照组相比，在灌喂氧乐果染毒后，AOPP组和大黄素组大鼠肺组织湿干质量比(W/D)显著增加(P<0.05)，大黄素组大鼠肺W/D在6h时与AOPP组比较差异无统计学意义(P>0.05)，在24 h和72 h时均显著低于AOPP组(P<0.05)(见图2)。

四、各组大鼠肺组织MDA、SOD、GSH-Px水平

图1 各组大鼠肺组织病理变化(HE×200)

注：A：健康对照组；B：AOPP组；C：大黄素组24 h；D：大黄素组72 h

图2 各组大鼠各时间点肺组织湿干质量比(W/D)变化

注：与健康对照组：*P<0.05；与AOPP组比较：#P<0.05

与健康对照组比较，AOPP组各时间点MDA水平明显升高(P<0.05)，大黄素组各时间点MDA水平较AOPP组显著降低，在72 h时与健康对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。AOPP组和大黄素组肺组织SOD、GSH-Px水平在各时间点较健康对照组显著降低(P<0.05)，大黄素干预后，大黄素组各时间点SOD、GSH-Px水平明显高于AOPP组(P<0.05)(见表1～3)。

表1 三组大鼠肺组织MDA水平

注：与健康对照组：*P<0.05；与AOPP模型组比较，#P<0.05

表2 三组大鼠肺组织SOD水平

注：与健康对照组：*P<0.05；与AOPP组比较：#P<0.05

表3 三组大鼠肺组织GSH-Px水平

注：与健康对照组：*P<0.05；与AOPP组比较：#P<0.05

五、各组大鼠肺组织Nrf-2，HO-1蛋白表达

与健康对照组比较，AOPP组和大黄素组24 h和72 h时Nrf-2，HO-1蛋白表达上调；与AOPP组比较，大黄素组24 h和72 h时Nrf-2，HO-1蛋白表达上调(均P<0.05)(见图3)。

讨 论

Nrf-2是机体内关键的内源性抗氧化应激调节因子，与机体内源性抗氧化损伤能力密切相关，其参与的信号通路在抗氧化应激损伤中居于核心地位。正常生理状态下，Nrf-2位于胞浆内，与细胞质接头蛋白(Kelch-like ECH associating protein 1，Keap-1)结合并以复合物的形式存在，当受到氧化应激信号刺激后，Nrf-2与Keap-1解偶联，磷酸化后入核，并与抗氧化反应元件结合，进一步诱导其调控的靶基因表达HO-1，SOD和GSH-Px等抗氧化酶，从而对抗氧自由基引发的氧化应激损伤，保护正常细胞免受其破坏[9]。在Nrf-2诱导产生的抗氧化酶中，HO-1在机体受到氧化应激刺激后最易被诱导表达。研究显示Nrf-2缺乏可导致下游抗氧化酶的表达减少，并在动物模型中表现为对多种肺部疾病易感[10]。在脂多糖诱导的急性肺损伤中，Nrf-2及其诱导的下游抗氧化酶可以发挥肺脏保护作用[11]，而Nrf-2的靶向缺失会导致新生小鼠肺氧化损伤，并损害肺发育[12]。

图3 各组大鼠肺组织Nrf-2，HO-1蛋白表达

本研究中，采用40%氧乐果20 mg/kg灌喂建立有机磷农药中毒急性肺损伤模型。实验中观察到大鼠灌喂氧乐果后出现一系列有机磷中毒症状，如四肢及全身肌肉震颤并有逐步加重趋势，同时有流涎、流泪症状、呼吸急促等。肺组织HE染色结果显示，健康对照组肺组织结构清晰，AOPP组HE染色病理形态符合急性肺损伤表现。另外，AOPP组氧乐果灌喂后，各时点肺组织湿干质量比较健康对照组明显增加，表明染毒后大鼠有明显肺水肿表现，结合上述几点可见本例中氧乐果致大鼠急性肺损伤模型构建是成功的。

MDA由氧自由基攻击细胞膜多不饱和脂肪酸产生，其能引起细胞膜结构的变化，影响细胞膜通透性和流动性。有研究[13]发现在脓毒症患者MDA升高与疾病严重程度及病死率密切相关。为抵抗氧化损伤，机体内同时存在抗氧化酶系统，以SOD和GSH-Px等为主，SOD主要清除超氧阴离子，GSH-Px能迅速清除过氧化氢，两者共同发挥作用，防止机体发生过氧化损伤[14-15]。本研究结果显示，AOPP组在给予氧乐果染毒后，MDA水平较健康对照组明显上升，SOD和GSH-Px活力显著低于健康对照组，同时大黄素组MDA水平低于AOPP组，SOD和GSH-Px活力明显高于AOPP组，表明大黄素在降低肺组织MDA生成同时，通过提高SOD和GSH-Px活力对抗氧化应激损伤。本研究进一步通过蛋白印迹实验对肺组织Nrf-2，HO-1蛋白进行检测，结果显示AOPP组和大黄素组24 h，72 h时Nrf-2和HO-1蛋白表达健康较对照组上调，提示氧乐果染毒后机体内源性Nrf-2/ARE信号通路激活以对抗氧化应激，表现为Nrf-2和HO-1蛋白表达上调，但随着时间延长及氧化损伤加重，Nrf-2和HO-1蛋白表达可受到抑制，因此可以观察到72 h时AOPP组HO-1蛋白表达较24 h时降低，但同时我们发现大黄素组24 h和72 h时Nrf-2，HO-1蛋白表达水平高于AOPP组(P<0.05)，说明大黄素可能通过调节Nrf-2/ARE信号通路促进了HO-1蛋白的表达。

综上所述，在大鼠AOPP致肺损伤模型中，大黄素可能通过调节Nrf-2/ARE信号通路上调Nrf-2及其介导产生的HO-1、SOD、GSH-Px等表达，降低MDA水平发挥保护肺损伤作用，而关于大黄素调节Nrf-2/ARE信号通路的具体分子机制有待后续研究进一步阐明。