0～3月龄婴儿化脓性脑膜炎脑脊液病原菌分布及耐药性分析

李雪琴 王 勤 王江涛 王晓玲 赵爱玲 谷惠茹

郑州大学附属儿童医院 河南省儿童医院 郑州儿童医院，河南 郑州 450018

化脓性脑膜炎(purulent meningitis，PM)又称细菌性脑膜炎，是各种化脓性细菌引起的脑膜炎症，部分患者病变累及脑实质，婴幼儿时期常见的中枢神经系统感染性疾病，婴幼儿病死率10%，10%～20%的幸存者遗留各种神经系统严重后遗症。PM后最常见的中度到重度后遗症是感觉神经性听力损失、神经运动障碍和智力低下，轻微的后遗症包括学习和行为障碍[1]。PM在出生后的第1个月比其他任何时期更常见，而且在婴儿中经常伴有早发型败血症和晚发型败血症[2]。头骨、脊椎、脑膜、血脑和血脑脊液界面的细胞屏障能很好地保护大脑和脑膜免受微生物入侵。然而，一旦进入血液，一系列病原菌就可能到达大脑并引起脑膜炎[3]。因此，早诊断、有效治疗对于PM的预后具有重要意义。脑脊液(erebrospinal fluid，CSF)检查是目前确诊本病的重要依据，为使患儿得到更有效的治疗，需了解PM的常见病原体及耐药情况。

多重耐药菌(multi-drug resistant organisms，MDRO)主要是指对临床使用的三类或三类以上抗菌药物同时呈现耐药的菌株。目前，由MDRO引起的严重感染的发病率在全球范围内呈上升趋势，越来越多的新生儿和儿童因耐药细菌而发生严重的血液感染[4]。0～3月龄PM患儿CSF病原菌的分布及耐药情况目前国内外报道甚少，本文对2015-01-01—2019-12-31在郑州大学附属儿童医院新生儿诊疗中心住院的0～3月龄PM患儿175株CSF培养阳性病原体进行回顾性分析，了解不同年龄段的PM患儿的病原体分布及随时间推移病原体的变迁，并将PM患儿病原菌的耐药情况作了进一步分析。

1 材料与方法

1．1标本来源及纳入标准标本来源于2015-01-01—2019-12-31在郑州大学附属儿童医院新生儿诊疗中心住院的0～3月龄患儿送检的5 310份脑脊液标本，共培养出阳性病原体175株，来自161位PM患儿，男女比例为1.3∶1，其中14例患儿CSF培养检测出2种病原体。同一患儿在同一住院期间分离的相同菌株不计入细菌总数。所有菌株按常规方法进行细菌分离、培养及鉴定。

纳入标准：161例CSF培养阳性的研究对象，其临床表现、病原学检查、血液非特异性检查及CSF检查均符合人民卫生出版社《儿科学》第9版化脓性脑膜炎诊断标准，年龄0～3月龄。

1．2仪器及方法为了解不同年龄组CSF病原菌分布情况，将0～3月龄入选患儿分为3组：早期新生儿组(0～7 d)、晚期新生儿组(8～28 d)及29 d～3月龄小婴儿组。CSF培养：对临床可疑中枢神经系统感染患儿，严格无菌操作下采集CSF 1～2 mL，1 h内送微生物室进行培养。按照《全国临床检验操作规程》进行培养、分离、鉴定。采用德国bruker质谱仪进行细菌鉴定，药敏试验采用法国梅里埃公司生产的VITEK2全自动细菌鉴定及药敏分析系统和美国BD全自动细菌鉴定及药敏分析系统，药敏试验采用MIC法，若培养5 d仍为阴性则报告阴性。

1．3结果判定检出率是指被检标本中阳性标本出现的百分率。耐药率是指耐药菌株占总检出菌株的百分比。构成比是表示某事物内部各组成部分在整体中所占的比重。最小抑菌浓度(MIC)指在体外能达到抑制细菌生长的最小抗菌药物浓度。药敏判定结果按照临床和实验室标准协会(CLSI)推荐的最新版《抗微生物敏感性试验的执行标准》要求进行。

1．4统计学方法采用统计软件SPSS 22.0进行数据分析。计数资料采用率或百分比(%)进行统计描述，组间比较采用χ2检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

本组患儿CSF培养共检出病原菌175珠，检出率3.3%(175/5310)。以革兰阳性(gram-positive，G+)菌为主，构成比68%(119/175)，革兰阴性(gram-negative，G-)菌的构成比为32%(56/175)。构成比排名前7位的分别为大肠埃希菌(34株)、表皮葡萄球菌(25株)、屎肠球菌(23株)、溶血葡萄球菌(17株)、人葡萄球菌(14株)、肺炎克雷伯菌(13株)；B群无乳链球菌(group B Streptococcus，GBS)(10株)。

2．1CSF培养病原菌的年龄组分布早期新生儿组检出41株，G+菌占73.2%(30/41)，G-菌占26.8%(11/41)；晚期新生儿组检出71株，G+菌占62%(44/71)，G-菌占38%(27/71)；29 d～3月龄小婴儿检出63株，G+菌占71.4%(45/63)，G-菌占28.6%(18/63)。3个年龄组病原菌G+菌、G-菌构成比差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 不同年龄组 G+菌、G-菌构成比比较

注：χ2=2.03，P=0.374

不同年龄组患儿的CSF菌株构成比排名又不尽相同。早期新生儿组排名前5位的菌株分别为表皮葡萄球菌 (12.2%，5/41)、肺炎克雷伯菌(12.2%，5/41)、GBS(9.8%，4/41)、人葡萄球菌(9.8%，4/41)、屎肠球菌(9.8%，4/41)；晚期新生儿组排名前5位的分别为大肠埃希菌 (25.3%，18/71)、表皮葡萄球菌(14.1%，10/71)、溶血葡萄球菌(14.1%，10/71)、屎肠球菌(12.7%，9/71)、肺炎克雷伯菌(8.5%，6/71)；29 d～3月龄小婴儿组排名前5位的分别为：大肠埃希菌(19.0%，12/63)、表皮葡萄球菌(15.9%，10/63)、屎肠球菌(15.9%，10/63)、人葡萄球菌(9.5%，6/63)、金黄色葡萄球菌(7.9%，5/63)。

2．2前后2.5aCSF培养病原菌检出情况比较2015-01-01—2017-06-30本中心PM患儿CSF培养共检出病原菌86株，其中G+病原菌64株，G-病原菌22株；2017-07-01—2019-12-31 CSF培养共检出病原菌89株，其中G+病原菌55株，G-病原菌34株。前后2.5 a比较，G+病原菌构成比呈下降趋势，G-病原菌构成比有上升趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2．3CSF培养药敏结果

2．3．1 CSF培养MDRO分布：本中心CSF培养病原菌共检出MDRO 77株，耐药率44%(77/175)，构成比排名前5位的MDRO依次为耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(methicillin-resistant coagulase negative staphylococci，MRCNS)(32.5%，25/77)、产超广谱-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase，ESBLs)菌株(22.1%，17/77)、耐甲氧西林表皮葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus epidermidis，MRSE)(19.5%，15/77)、碳青霉烯类耐药肠杆菌(carbapenem-resistant enterobacteriaceae，CRE)(14.3%，11/77)、氨基糖苷类高水平耐药 (high-level aminoglycoside resistant，HLAR)菌株(7.8%，6/77)。6株HLAR菌株全部为屎肠球菌；17株ESBLs菌株中15株为大肠埃希菌菌，2株为肺炎克雷伯菌；11株CRE菌株中10株为肺炎克雷伯菌，1株为大肠埃希菌。CSF病原菌中G-菌的耐药率(58.9%，44/119)明显高于G+菌的耐药率(37%，33/56)，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表2 前后2.5 a G+菌、G-菌构成比比较

注：χ2=3.202，P=0.078

表3 CSF中G+及G-菌株耐药率比较

注：χ2=7.449，P=0.009

2．3．2 CSF培养病原菌对常用抗生素耐药情况：本中心CSF培养构成比排名前6位的病原菌G-菌株包括大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌，G+菌株包括表皮葡萄球菌、屎肠球菌、溶血葡萄球菌及人葡萄球菌。检出率较高的G+菌株对常用抗生素的耐药情况见表4，G-菌株对常用抗生素的耐药情况见表5。大肠埃希菌耐药率为0的仅有阿米克星，哌拉西林耐药率为100%，耐药率<10%的有美罗培南、亚胺培南、哌拉西林他唑巴坦。肺炎克雷伯菌耐药率均在50%以上，美罗培南、亚胺培南、哌拉西林他唑巴坦耐药率均为83.3%。表皮葡萄球菌、屎肠球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌对万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺的耐药率均为0。表皮葡萄球菌对氨苄西林及青霉素的耐药率均为100%，溶血葡萄球菌对红霉素的耐药率为100%，屎肠球菌对克林霉素、利福平、复方新诺明及阿米卡星的耐药率均为100%。真菌对常用抗真菌药物均敏感。

表4 G+菌株对常用抗生素的耐药率

3 讨论

2015—2019年郑州大学附属儿童医院新生儿诊疗中心共收集0～3月龄PM患儿CSF培养阳性病原菌175珠，总检出率3.3%(175/5 310)，明显低于我国华南部分地区新生儿细菌性脑膜炎脑脊液的病原体阳性培养率33.0%[5]，考虑与我院临床医师更重视脑CSF原菌的培养，CSF标本送检率较高有关，其中一部分患儿最终并未临床诊断为PM，至CSF病原菌阳性检出率较低；另外，考虑与本院患儿大多数是由外院转诊入院，在进行CSF培养前已应用抗菌药物有关。目前已有利用基因测序快速诊断细菌性脑膜炎的检测方法[6-7]，在此技术还未广泛应用于临床之前，虽然CSF培养阳性率较低，但仍能够有效指导临床合理用药。

不同年龄段的PM患者CSF常见病原菌亦存在差异。成人及儿童PM病原体有很大差别，方霞等[8]报道当地成人PM病原体以新型隐球菌感染为主，但儿童新型隐球菌感染少见。不同年龄段的儿童PM病原体亦有差异，文献报道新生儿PM最常见的病原菌是GBS和大肠埃希菌[3]。本研究0～3月龄PM患儿CSF病原菌检出率排名前7位的分别为大肠埃希菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、GBS，G+菌构成比68%(119/175)，G-菌的构成比为32%(56/175)。本文GBS检出率较国内外文献报道低，考虑可能与我院没有产科，患儿主要来源为各地危重症患儿转诊，可能存在大量轻症GBS患儿未到我院就诊有关。

表5 G-菌株对常用抗生素的耐药率

本文早期新生儿组GBS构成比排名较其他两组靠前，考虑与孕母GBS感染所致宫内感染或经阴道分泌物垂直传播有关。晚期新生儿及小婴儿组CSF培养大肠埃希菌构成比均排名第1位，与ZHAO等[9]的报道相符，考虑与此年龄段患儿易暴露于大肠埃希菌有关。同时，我院住院新生儿多为医联体单位转诊的重症患儿，机械通气的比率较高，外院住院有应用抗菌药物史，医院感染率较高亦不能除外。68%的G+菌中以凝固酶阴性葡萄球菌(coagulase negative staphylococci，CNS)为主，CNS是皮肤、口腔黏膜等部位的正常菌群，以往临床中常把CNS视为污染菌，但近年来国内文献报道CSF培养阳性菌主要为CNS[10]，国外文献亦有条件葡萄球菌致人类脑膜炎的报道[11]，因此，当CSF中检出CNS，应结合患儿的临床表现和CSF常规、生化、血培养等检查结果判断是否为致病菌，避免不合理用药。

本中心2015-01-01—2017-06-30 PM患儿CSF培养检出细菌中G+菌构成比为74.4%，G-菌构成比为25.6%，2017-07-01—2019-12-31 PM患儿CSF培养检出细菌中G+菌构成比为61.8%，G-菌构成比为38.2%，前后2.5 a比较，G+菌构成比呈下降趋势，G-菌构成比呈升高趋势，虽差异无统计学意义(P=0.078)，但已有文献报道新生儿CSF培养病原菌中G-菌有逐年上升趋势[10]，应继续监测其动态变化。

随着抗生素的广泛应用，病原菌耐药现象已引起全球关注。已有文献综述抗生素的使用与随后的医院感染或MDRO在儿童中的定植之间呈正相关[12]。本研究PM患儿CSF培养病原菌的多重耐药率高达(44%)，G-菌的耐药率(58.9%)高于G+菌(37%)(P<0.05)。检出率排名前5位的MDRO重点菌分别为MRCNS、ESBLs菌株、MRSE、CRE、HLAR菌株。6株HLAR菌株全部为屎肠球菌，ESBLs菌株中主要为大肠埃希菌(88.2%)，CRE菌株中主要为肺炎克雷伯菌(88.2%)。段雪亚等[13]报道当地神经内外科住院患者CRE中肺炎克雷伯菌占86.78%，FANG等[14]报道肺炎克雷伯菌是CRE的主要分离株，占标本的74.5%，与本研究结果基本相符。近几年来，CRE在世界范围内迅速蔓延，给人类健康带来了巨大的挑战，质粒介导的碳青霉烯类耐药基因水平传播是CRE流行激增的主要原因。产生对碳青霉烯类抗生素耐药性的主要机制有3种：酶的产生、外排泵和孔蛋白突变，其中酶的产生是主要的抗性机制，对碳青霉烯类耐药主要有三类酶，所有这3组酶都是质粒介导的[15]。治疗CRE感染的一线抗生素目前为多黏菌素，与多黏菌素相比，新的抗CRE抗生素，如头孢他啶-阿维巴坦、美罗培南-瓦博巴坦、广场霉素改善了CRE感染患者的预后，并降低了毒性，有望成为一线用药[16]。MRCNS为低毒性条件致病菌，感染后症状不典型，且呈多重耐药现象，给临床诊断及治疗带来一定难度。加强感染预防，包括手部卫生、监测培养、接触预防、选择性隔离和抗生素管理是减少病区耐药性的重要策略[17]。相关文献报道个性化检测病原菌可能与降低ICU中的MDRO有关[18]。相关疫苗研制也为人类预防及治疗细菌性脑膜炎带来了希望。研究显示，部分益生菌具有抗CRE活性，为控制或预防CRE定植或感染提供了潜在的应用前景[19]。

目前，有关G+菌株耐药的报道逐年增多。本中心CSF中表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌对万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺的耐药率均为0，对青霉素的耐药率分别为100%、87.5%、92.9%，提示青霉素已不再是治疗PM的首选抗菌药物。屎肠球菌对克林霉素、利福平、复方新诺明、庆大霉素、阿米卡星耐药率均为100%，临床不宜选用，对万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺的耐药率均为0，因此，这3种药物对耐药的屎肠球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、溶血葡萄球菌感染的治疗效果相对可靠。文献报道呋喃妥因对万古霉素耐药的肠球菌具有较好的体外抗菌作用[20]，本研究中屎肠球菌对呋喃妥因的耐药率为仅9.1%，仅次于万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺，所以呋喃妥因亦为临床治疗提供了新的选择。本研究显示G-菌的耐药率明显高于G+菌。大肠埃希菌对哌拉西林耐药率为100%，对氨苄西林的耐药率为96.7%，但对哌拉西林他唑巴坦、亚胺培南、美罗培南的耐药率在10%以内，对阿米卡星耐药率为0，可供临床选用抗菌药物参考。肺炎克雷伯菌的耐药率除莫西沙星(50%)和氯霉素(63.6%)外，其他常用抗菌药物耐药率均在70%以上，临床选药比较困难。最近研究表明，对抗细菌穿透血脑屏障的靶点在改善细菌性脑膜炎的预后方面是抗菌治疗的有益辅助治疗手段[21]。建立机构抗菌药物管理计划被认为是减少医院抗生素消费和解决MDRO高比率的关键干预措施。

郑州大学附属儿童医院0～3月龄PM患儿CSF病原菌以G+菌为主，大多数是条件致病菌，G-菌的耐药率高于G+，考虑因近年来大量广谱抗菌药物的广泛使用所致。不同年龄组病原菌分布又有所差别。临床医生详细了解病区感染病原菌分布及耐药性变化趋势，能更有针对性地应用抗菌药物，指导临床治疗。