几种常见生食水产品中生物危害与化学危害测定分析

谢庆超，张红敏，刘海泉，王锡昌，潘迎捷，赵勇,4*

(1.上海海洋大学食品学院；2.农业农村部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(上海)；3.上海海洋大学食品质量安全检测实验室；4.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心: 上海201306)

生食水产品营养物质种类全面、风味独特，赢得不少消费者的青睐。近年来人们的食品安全意识日渐增强，因此，生食水产品的安全问题也逐渐受到重视。生食水产品以海产品为主，而根据来源海产品又可分为近海产品和外海产品。有研究表明，近海生食水产品如三文鱼(Oncorhynchus)、牡蛎(Ostreagigasthunberg)、北极贝(Pseudocardiumsachalinense)、扇贝(Pectinidae)、甜虾(Pandalusborealis)、寿司虾(Penaeuschinensis)、海胆(Echinoidea)和兰花蚌(Pseudocardiumsachalinense)等更易受生物及化学性污染[1]。其中，近海生食水产品引起的肠胃炎等各类食源性疾病[2-5]的主要病因是食源性病原微生物，如副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus，简称Vp)[6]等。Vp是一种广泛存在于水产品中的海洋细菌及人类病原菌，在热带和温带的沿海环境中，尤其是在温度较高时，Vp易附着或者侵入浮游动物、鱼类和贝类等水产品中。以牡蛎为例，其作为近海养殖的海产品，产量位于中国海水养殖产品首位，2018年产量达500余万 t[7]。受加工方式影响，牡蛎肠道常常被人们与肌肉部分同时摄入，由于其肠道中含有大量可导致人体感染胃肠道疾病的微生物，因此，有必要对牡蛎肠道微生物情况进行调查研究。三文鱼、北极贝、扇贝、甜虾、寿司虾、海胆和兰花蚌等其他近海生食水产品虽然产量和销量不及牡蛎，但也面临着同样的质量安全问题。外海生食水产品则以重金属富集危害为主，金枪鱼(Thunnus)为中国主要食用的外海生食海产品，其年均消费量在20万 t以上[8]并呈逐年增加的趋势。由于金枪鱼等大型鱼类位于食物链的顶端，体内富积的汞等重金属含量较高，在微生物的作用下也易形成毒性更强的甲基汞[9]。甲基汞是一种具有较强神经毒性的污染物质[10]，有关国际组织和世界主要贸易国家为保护消费者健康，纷纷制定了鱼类中重金属汞的污染限量，中国对肉食性鱼类的甲基汞限量为1.0 mg/kg[11]。

为了保证生食水产品质量安全，本研究以常见的近海生食产品牡蛎和远海生食产品金枪鱼为主要研究对象，同时包含市面上常见的其他几类生食水产品，通过分离样品中Vp并鉴定其16S rDNA和毒力基因，测定了水产品中主要病原微生物的污染情况。另外，通过宏基因组测序法和HPLC-ICPMS方法，研究牡蛎中的微生物菌群和金枪鱼中的重金属汞含量，以期进一步评估影响生食水产品质量安全的关键生物及化学危害因子。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本采集

地点及时间对象：2017年5—10月间对上海市东方国际水产市场、上海市江阳水产市场、浙江省宁波市路林水产市场以及福建省厦门市夏商国际水产市场所售三文鱼、金枪鱼、牡蛎、北极贝、扇贝、甜虾、寿司虾、海胆和兰花蚌进行取样。样品编号及各地具体取样情况见表1。

样品采样与处理：受时间等因素影响，本研究采集三文鱼样品24个、北极贝样品10个、金枪鱼样品7个、牡蛎样品7个、寿司虾样品6个、甜虾样品2个、扇贝样品2个、海胆样品1个及兰花蚌样品1个，共计采样60份，每份约500.0 g。镊子、手术刀及手术剪经高压灭菌后，将样品剪碎装入无菌袋中待下一步处理。

1.1.2 试剂

主要包括：TSB(3% NaCl)培养基与TCBS培养基(北京陆桥技术责任有限公司)；细菌DNA提取试剂盒、肠道总DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)；Taq DNA聚合酶、dNTP(TaKaRa公司)；浓硝酸、乙酸铵(上海安谱)；金标准溶液、汞标准溶液(1 000 μg/mL，国家有色金属及电子材料分析测试中心)；氯化甲基汞标准溶液(100 μg/mL，Reagecon)；氨水(国药)；L-半胱氨酸盐酸盐(SIGMA)。

表1 试验样品信息表Tab.1 Sample information

1.1.3 仪器设备

主要包括：离心机(5810R，Eppendorf)；PCR仪(6235，Eppendorf)；电泳及凝胶成像分析系统(GelDocXR，Bio-Rad)；酶标仪(Synergy 2，BioTek)；隔水式恒温培养箱(GHP-9270，上海一恒科技有限公司)；均质器(BagMixer，Interscience)；液相色谱-电感耦合等离子体质谱仪(iCAP Q，Thermo Scientific)；微波消解仪(MARS 6，CEM)；超纯水仪(Advantage A10，Millipore)。

1.1.4 引物

所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.5 微生物菌群分析

提取DNA后，送至上海美吉生物医药科技有限公司完成分析。

1.2 方法

1.2.1 生食水产品中Vp分离鉴定方法

参考GB 4789.7—2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验》[12]中的方法，对样品中的Vp进行分离并富集培养：取样品25 g放入无菌均质袋，加入225 mL 3%NaCl碱性蛋白胨水均质后，于37 ℃培养18 h。后接种到TCBS培养基培养，进行生化鉴定，用甘油管保存阳性菌株存放于-80 ℃冰箱，备用。

1.2.2 Vp毒力基因测定及16S rDNA分型方法

1.2.2.1 细菌DNA提取

取-80 ℃保存下甘油管中菌种液划线接种于TCBS平板，挑取单菌落于10 mL TSB(3% NaCl，pH=8.0)试管中，在37 ℃转速为180 r/min的摇床中培养10 h。使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取阳性样品菌株DNA。提取的DNA用酶标仪检测浓度以及纯度(A260/A280值)。

1.2.2.2 PCR体系及反应条件[13]

在25 μL的PCR反应体系下，用PCR进行16S rDNA和毒力基因tdh、trh、tlh扩增(引物信息见表1)。得到的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，经过blast比对，确认其是目的片段。

表2 引物序列信息Tab.2 Primer sequences information

1.2.3 牡蛎中肠道微生物菌群多样性分析方法

用肠道总细菌DNA提取试剂盒提取7个牡蛎肠道样品总DNA，用酶标仪检测浓度，在浓度高于500 ng/μL后，送至上海美吉生物医药科技有限公司进行测序分析，在上海美吉生物医药科技有限公司I-Sanger V4.0分析平台对测序结果进行分析。

1.2.4 金枪鱼中总汞及甲基汞含量分析

总汞测定：参考GB 5009.268—2016《食品安全国家标准 食品中多元素的测定》[14]中的方法，样品经微波消解后用ICP-MS内标法测定总汞含量。

甲基汞测定：参考SN/T 4851—2017《出口水产品中甲基汞和乙基汞的测定液相色谱-电感耦合等离子体质谱法》[15]中的方法，样品经前处理后用HPLC-ICP-MS外标法测定甲基汞含量。

1.2.5 数据处理

使用Microsoft Excel 2010进行作图，并进行方差分析，使用SPSS 22.0进行差异显著性分析。

2 结果与讨论

2.1 生食水产品中Vp分离鉴定结果

经测定，60个样品中共检出7个Vp阳性样品，样品检出率为11.7%。9种样品中共有4种样品检出，且检出率由高至低依次为：牡蛎(28.6%)>金枪鱼(14.3%)>三文鱼(12.5%)>北极贝(10.0%)(图1)。对检出率进行显著性分析表明，牡蛎检出率显著高于其他产品(P<0.01)。李海麟等[16]对2009—2014年广州市生食水产品Vp的监测结果显示，总体检出率为11.6%，具体到品种，检出率由高至低依次为：牡蛎(44.4%)>红立鱼(33.3%)>北极贝(5.88%)>三文鱼(5.26%)。其中，总体检出率与本研究结果非常接近，且检出率最高的同样是牡蛎，说明牡蛎是生食水产品中感染Vp的主要品种；北极贝与三文鱼检出率同样比较接近，但检出率均低于本研究。

图1 生食水产品中副溶血性弧菌鉴定结果
不同小写字母检出率差异显著(P<0.01)。
Fig.1 Identification ofVibrioparahaemolyticusin raw aquatic products
Different small letters show significant difference detetion rate.

在夏、秋季节，沿海地区的消费者喜爱生食或半熟的海产品，这些海产品通常以散装冰鲜方式保存，易造成交叉污染[17]，当人们食用了感染副溶血性弧菌的食品后有可能导致肠胃炎等疾病[18]。以2007年上海市肠道疾病调查为例，由食源性致病菌导致的肠道疾病占总肠道疾病的12.82%，其中，由Vp引发的疾病占76.92%[19]。本研究表明，牡蛎、三文鱼及北极贝均为近海养殖海产品，与近海生食水产品更易遭受生物性污染[1]的特征相符。金枪鱼直接感染Vp的报道较少，仅见2007年广东省出入境检验检疫局在一批进口鲜黄鳍金枪鱼中检出Vp[20]，本研究的金枪鱼中有1个样品检出，可能与后期加工过程中交叉污染有关。这也提示了在食用生食水产品过程中，应注意生熟分开、厨具消毒，避免产生交叉污染。

2.2 副溶血性弧菌毒力基因测定及16S分型结果

分别提取上述7个阳性样品中的菌株DNA，并将提取得到的DNA用酶标仪检测纯度，A260/A280值均在1.8～2.0之间，表明此次实验提取的DNA纯度较高。随后经过PCR扩增及产物测序，发现只有5株菌株含有tdh毒力基因(图2)。而16S分型结果显示，同一品种的生食水产品(RA4和RA15)分离得到的Vp反而亲缘关系较远，而采样地理位置较近的样品(RA4和RA8、RA15和RA28、RA17和RA22)分型结果较为接近，表明样品中的Vp极有可能是在后期销售环节通过交叉污染获得的(图3)。

从图3可知，RA4和RA8号样品，RA17和RA22、RA24号样品，以及RA15和RA28号样品均是所属于相邻的两个商铺。值得注意的是，RA8和RA17号样品来源的两个商铺仅一墙之隔。推测相邻的商铺间共用冰块以及人员的互相往来等行为，都有可能是导致Vp在样品间交叉污染的原因。

图3 阳性样品采样地理位置示意图
Fig.3 Sampling location diagram of positive samples

注: 表示F区样品, 表示K区样品, 表示道路。

曹慧慧等[21]在对中国8个沿海城市的水产品调查中发现，62.7%的水产品tlh检测呈阳性，即这些阳性水产品全都污染了Vp。本研究中，所有生化鉴定阳性菌株tlh检出率为100%，阳性菌株tdh毒力基因检出率为71.4%(5/7)，未检出trh毒力基因。tdh毒力基因占全部样品的8.3%(5/60)。Vp通过释放溶血毒素导致人体腹泻。耐热直接溶血素(TDH)被认为是导致肠胃炎的诱因，而溶血素相关溶血素(TRH)的氨基酸序列67%与TDH同源，TDH和TRH它们分别由tdh和trh毒力基因编码，二者都能诱导人结肠上皮细胞氯化物分泌[22]。不耐热溶血素(TLH)的致病机制尚不明确，但其编码基因tlh可以同时存在于临床分离和环境分离菌株中，因此常用于Vp的分子诊断。所以，不是所有阳性样品均会致人出现腹泻等疾病，检出阳性样品后应该进一步测定tlh基因以判断是否是Vp而不是其他弧菌属(Vibrionaceae)细菌，并测定tdh和trh毒力基因以确定致病性。

2.3 牡蛎肠道微生物菌群多样性分析结果

通过I-Sanger分析平台对测序结果从属的水平进行分析(图4)。以样本名为纵坐标，菌群物种在该样本中所占的比例为横坐标，柱颜色的代表不同的菌群物种，柱长度代表该菌群物种所占比例大小。从图4可知，含量占比前5位的细菌分别为：拟杆菌(Bacteroides)、芽孢杆菌(Bacilluscohn)、假单胞菌(Pseudomonas)、弧菌(Vibrio)及嗜盐杆菌(Halobacteriumelazari-volcani)，包含了两类腐败菌属(拟杆菌、假单胞菌)和一类致病菌属(弧菌)。拟杆菌是水产品加工过程中易感染的腐败菌，假单胞菌是冷藏水产品中的优势腐败菌，弧菌是新鲜水产品中的优势腐败菌以及致病菌[23]。

图4 牡蛎肠道中微生物菌群多样性分析
Fig.4 Diversity analysis of microbial flora in oyster intestine

本研究中，拟杆菌、假单胞菌和弧菌3种菌在牡蛎肠道中占比均很高，推断肠道微生物是引起水产品腐败变质的主要污染源之一。陈慧斌等[24]研究了4 ℃冷藏期间牡蛎鳃部菌群的动态变化，发现冷藏后期主要腐败优势菌群为假单胞菌属和气单胞菌属等。但目前对于水产品中肠道细菌种群特征的研究甚少。新鲜牡蛎因其自身蛋白质含量较高，更有利于微生物的繁殖[25]，进而影响牡蛎的K值、TVB-N值、质构和颜色等，因此微生物菌群可作为反映水产品新鲜度和腐败程度的一项重要指标[26]。同时，一些致病微生物会直接进入人体消化道导致一系列肠胃疾病[19]。因此，食用牡蛎前要注意流通运输过程中的冷藏保鲜，避免由肠道微生物过量生长导致腐败引发的胃肠道疾病的产生[27]。

2.4 金枪鱼中总汞及甲基汞含量分析结果

长期食用汞含量高的食品易对人体，尤其是胎儿或婴幼儿造成极大的损害，如甲基汞可干涉大脑组织的发育，破坏微血管，并影响引导神经移动和连接的细胞粘连分子的时间次序[28]。而鱼类吸收甲基汞的效率极高，且清除速度缓慢，导致其体内的甲基汞大部分都蓄积在肌肉组织中。金枪鱼作为食物链顶端的大型食肉鱼类，成为了富集甲基汞的载体。为全面了解生食水产品的潜在风险，同时对金枪鱼的汞等化学污染因子进行了含量测定。结果如图5所示，经测定，样品中总汞含量最高达2.19 mg/kg(RA59)，a表示对总汞含量进行显著性分析，RA59显著高于其他产品(P<0.01)。Martin等[29]的研究发现，鱼的营养级越高、鱼龄越大，甲基汞在鱼肌肉组织中的蓄积含量也越高。也有研究指出,在鱼肠和鱼肝中可以发生汞的甲基化反应,但鱼类体内自身合成的甲基汞仅占总甲基汞含量的很小一部分,外部输入仍是主要的甲基汞来源[30]。通常鱼体内甲基汞含量约占总汞的80%[9]，而且鱼类寿命越长，个体越大，体内汞含量越高。因此，本研究中有两个样品总汞含量高可能是鱼龄较长导致的。但从甲基汞含量的结果可知，甲基汞含量最高为0.916 mg/kg(RA39)，低于国家污染物限量标准规定的肉食性鱼类甲基汞限量值(1.0 mg/kg)，A表示对甲基汞含量进行显著性分析，RA39和RA59显著高于其他产品(P<0.05)。由于汞在食物链中的逐步富集以及可透过血脑屏障的特性，频繁大量食用会对孕妇、哺乳期妇女和幼儿造成健康威胁，建议尽快发布中国居民相关鱼类汞污染的食用风险警示。

图5 金枪鱼中总汞及甲基汞含量分析
不同大写字母表示甲基汞含量差异显著(P<0.05),不同小写字母代表汞含量差异显著(P<0.01)。
Fig.5 Content analysis of total mercury and methyl mercury in tuna
Different capital letters show significant difference in metyl mecury content (P<0.05).Different small letters show significant difference in total mercury content(P<0.01).

3 结论

本研究评估了几种常见生食水产品质量安全的关键生物及化学危害因子情况。生物危害方面：经副溶血性弧菌生化鉴定，60个样品中共检出7个阳性样品，检出率为11.7%；对阳性菌株进行毒力基因判定，只有5株菌株含有tdh毒力基因，占全部样品比例为8.3%；对7个牡蛎肠道中微生物群落分布的研究结果表明，优势菌群中大多数为腐败菌，存在一定生物危害风险。汞危害方面：对7个金枪鱼样品中的汞含量分析研究结果显示，2个样品总汞含量超标，但经测定甲基汞含量均未超标。综上，建议相关部门加强对生食水产品中生物危害因子的调研排查及风险管控工作。