QuEChERS-UPLC-MS/MS法测定水产品中孔雀石绿和酰胺醇类抗生素残留量

陈永平，韩现芹，付志茹，陈建，李春青，李宝华

(农业农村部渔业环境及水产品质量监督检验测试中心(天津)，天津 300221)

孔雀石绿类和酰胺醇类药物因具有抗菌谱广、价格低廉及药效稳定等特点，曾在水产养殖和鲜活水产品运输过程中被广泛应用[1-2]，用于预防和治疗细菌感染性疾病。但该类药物可以在水产品组织中富集，对消费者健康造成危害。研究表明，孔雀石绿(malachite green，MG)被动物体吸收后会迅速代谢为隐色孔雀石绿(leucomalachitegreen，LMG)，其在鱼体内代谢消除速率缓慢，残留时间较长，且LMG可对人类产生致畸、致癌及致突变等副作用[3]。氯霉素(chloramp-henicol，CAP)属酰胺醇类药物，可引起人体再生障碍性贫血和粒状白细胞缺乏症等疾病，还会使致病菌产生耐药性[4-5]。目前许多国家已将CAP和MG列为水产养殖禁用药物，中国也明确规定禁用CAP和MG，在动物性食品中不得检出。甲砜霉素(thiamphenicol，TAP)和氟甲砜霉素(florfenicol，FF)因具有抗菌谱广、吸收迅速且无交叉耐药性等特点，已成为了CAP的主要替代药物[6]，各国分别制定了二者在可食性动物组织中的最高残留限量[7-8]。

目前，水产品中孔雀石绿类和酰胺醇类检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[9-13]、气相色谱法(GC)[14-15]、气质联用法(GC-MS)[16-17]和液质联用法等[18-27]。谢世红等[1]通过液相质谱法同时测定水产品中MG和CAP残留，该方法经乙腈提取直接过氧化铝柱，杂质去除效果有限，易产生干扰。李丽春等[28]通过QuECHRS结合UPLC-MS/MS法测定水产品中酰胺醇类抗生素残留及基质效应，该方法以酰胺醇类为研究对象，以酸化乙腈作为提取剂，上清液直接过微滤膜上机，但没有涉及其他渔药残留的测定，检测效率尚有提升空间。本研究通过优化仪器参数和前处理条件，建立了同步快速测定水产品肌肉组织中孔雀石绿类和酰胺醇类抗生素残留量的超高效液相色谱-串联质谱分析方法，该方法检测时间短、检测成本低且效率高，具有操作简单、快速及灵敏等特点，适用于水产品中孔雀石绿类和酰胺醇类抗生素残留量的测定。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

主要包括：孔雀石绿(MG)、隐色孔雀石绿(LMG)、氘代孔雀石绿(MG-D5)、氘代隐色孔雀石绿(LMG-D6)、氯霉素(CAP)、甲砜霉素(TAP)、氟甲砜霉素(FF)和氘代氯霉素(CAP-D5)(纯度≥98%,德国Dr.Ehrensorfer公司)；甲醇、乙腈、乙酸乙酯和甲酸(色谱纯，美国Fisher公司)；N-丙基乙二胺(PSA)(分析纯，美国CNW公司)；氯化钠和无水硫酸镁(分析纯，天津龙腾化工有限公司)；实验用水为超纯水。

1.2仪器和设备

主要包括：AB 5500 Qtrap三重四极杆质谱(AB Sciex公司)；电子天平(Sartoriusgz公司)；高速冷冻离心机(Sigma公司)；高速组织匀浆机(IKA T25飞利浦公司)；MS1 Mini-shaker 涡轮振荡器(IKA公司)；MiLLi-Q纯水器(Millipore公司)；氮吹仪(Organomation Associates公司)；超声波震荡仪(BUCHI公司)；移液器 (Eppendorf公司)。

1.3 方法与步骤

1.3.1 标准溶液配制

准确称取MG、LMG、孔雀石绿内标(MG-D5)、隐色孔雀石绿内标(LMG-D6)、CAP、TAP、FF及氯霉素内标化合物(CAP-D5)各10 mg，分别用乙腈定容至100 mL，配制成质量浓度为100.0 μg/mL的单内(外)标准储备液，在-18 ℃下避光保存。吸取各外标储备液1.0 mL，乙腈定容至100 mL，配制成1.0 μg/mL混合外标中间液。吸取各内标储备液1.0 mL，乙腈定容至100 mL，配制成1.0 μg/mL混合内标中间液。取上述中间液，用乙腈稀释成不同浓度的混合标准工作液，现配现用。

1.3.2 样品前处理

分别准确称取草鱼(Ctenopharyngodonidellus，购于天津水产品批发市场)和南美白对虾(Penaeusvannamei，购于天津水产品批发市场)肉糜样品5.00 g于50 mL塑料离心管中，加入100.0 ng/mL MG-D5、LMG-D6和CAP-D5内标标准混合工作溶液30 μL于1.3.1中已配好的混合标准工作液，然后加入10 mL乙腈、3 g无水硫酸镁和2 g氯化钠，同时加入150 mg PSA。涡旋提取1 min，超声波振荡10 min，8 000 r/min离心3 min，移取上清液至15 mL玻璃离心管中，50 ℃下氮吹至近干，1 mL乙腈水(1∶1，V/V)定容，过0.22 μm微滤膜，待UPLC-MS/MS测定。

1.3.3 液相色谱条件

色谱柱为岛津Shim-pack XR-ODS (75.0 mm × 2.1 mm i.d., 2.0 μm particle size)；流动相A为甲醇，流动相B为超纯水；流速0.35 mL/min; 柱温40 ℃，进样体积3.0 μL。采用梯度洗脱分离孔雀石绿和酰胺醇类化合物，洗脱条件见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序Tab.1 The gradient elution process of each mobile phase

注：φ(A)示流动相A体积分数，φ(B)示流动相B体积分数。

1.3.4 质谱条件

离子化模式为电喷雾离子源(ESI)正负离子切换模式；离子源温度500 ℃；气帘气20 psi；碰撞气(CAD)Medium；喷雾电压±5 000 V；辅气1为60 psi；辅气2为40 psi；扫描模式为多反应监测(MRM)，反应监测母离子、子离子、锥孔电压和碰撞能量见表2。

表2 目标化合物质谱条件Tab.2 Mass spectrometric conditions for monitoring the target compounds

续表2,Tab.2 Continued

注：“*”代表定量离子。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 流动相的选择

为同时使孔雀石绿类和酰胺醇类药物达到满意的分离效果，选取了甲醇-0.05%甲酸水溶液、乙腈-0.05%甲酸水溶液、甲醇-水和乙腈-水 4 种不同的流动相体系进行对比。实验结果表明：甲醇-0.05%甲酸水溶液、乙腈-0.05%甲酸水溶液作为流动相可提高MG的离子化程度，但低浓度的甲酸水对负离子模式下酰胺醇类药物的信号响应有抑制作用，对TAP素信号抑制作用尤为明显；甲醇-水、乙腈-水作为流动相，以甲醇-0.05%甲酸水或甲醇-水为流动相均可以实现分离(图1)，乙腈-水作为流动相时LMP信号响应值较甲醇-水作为流动相时低(图2)，采用甲醇-水作为流动相，并未出现明显的峰拖尾现象(图1)，因此，选择甲醇-水作为流动相。

图1 甲醇-水作为流动相总离子流图
Fig.1 Total ion chromatogram for methanol-water as mobile phase

图2 乙腈-水作为流动相总离子流图
Fig.2 Total ion chromatogram for acetonitrile-water as mobile phase

2.1.2 色谱柱的选择

分别选择Thermo C18柱(100.0 mm×2.1 mm i.d.，5.0 μm particle size)，Shim-pack XR-ODS C8柱(75.0 mm×2.1 mm i.d.，2.0 μm particle size)以及Phenom-enex XB-C18柱(150.0 mm×2.6 mm i.d.，2.6 μm particle size)，以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱。结果发现，Thermo C18柱，化合物峰型较宽，不适用于痕量检测；Phenom-enex XB-C18柱，分离效果欠佳，有色孔雀石绿不出峰；Shim-pack XR-ODS C8柱峰型和分离效果均优于Thermo C18柱和Phenomenex XB-C18柱，因此，最终实验选择Shim-pack XR-ODS C8柱(75.0 mm×2.1 mm i.d.，2.0 μm particle size)作为孔雀石绿类和酰胺醇类药物分离色谱柱。

2.2 质谱扫描方式的选择优化

为获得孔雀石绿类和酰胺醇类化合物理想的信号强度，选择3种扫描方式：(1)分段扫描方式，0～3.5 min负离子扫描，3.5～6.0 min正离子扫描方式；(2)0～6.0 min正负离子切换扫描；(3)Schedule扫描方式，在化合物保留时间±30 s设定扫描。采用扫描方式(1)，LMG和酰胺醇类药物信号强度较高，有色孔雀石绿信号强度较弱(图3)；采用扫描方式(2)，峰型和响应强度均较好(图4)；采用扫描方式(3)，峰型欠佳，易受保留时间不稳定的限制。实验最终选择正负离子切换扫描方式扫描(图5)。

图3 Thermo C18柱分离效果图
Fig.3 Chromatogram for separation effect on Thermo C18

图4 分段扫描模式色谱图
Fig.4 Chromatogram for different-period scanning mode

图5 Schedule模式扫描色谱图
Fig.5 Chromatogram for schedule scanning mode

2.3 提取溶剂的选择

根据孔雀石绿类和酰胺醇类化合物的极性特点，分别选择常用的有机提取溶剂乙腈、酸化乙腈(0.1%盐酸)、乙酸乙酯和二氯甲烷进行提取效果的比较。选取空白草鱼肌肉样品进行加标回收实验测定，各组分添加量均为10.0 μg/kg，通过比较回收率评价各种提取剂的提取效果。如图6所示，乙酸乙酯对酰胺醇类化合物的提取效果最好，提取效率最高，但对MG和LMG的提取效果差，提取效率低；二氯甲烷对MG和LMG取效果最好，但由于水产品基质复杂，大部分基质含有大量的脂肪和蛋白质，提取后仍需固相萃取柱净化后才能上机，步骤多而耗时；乙腈和酸化乙腈提取效果均较好，乙腈的极性较大，具有沉淀蛋白作用，配合使用QuEChERS方法，去除脂肪和蛋白质效果较好。而酸化乙腈提取吹干定容后上机，残留的酸会对酰胺醇类化合物产生信号抑制，重复性不理想。综上，最终实验选择乙腈作为该方法的提取试剂。

图6 不同提取试剂对孔雀石绿和酰胺醇类化合物提取回收率的影响(n=6)
Fig.6 The effects of different extracting solution for the recovery of malachite green and amphenicols (n=6)

2.4 标准曲线、检出限和定量限

用乙腈将MG、LMG、TAP、CAP和FF标准溶液稀释成梯度混合标准液，MG、LMG、CAP和FF质量浓度均分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0和50.0 ng/mL，TAP质量浓度为2.0、5.0、10.0、20.0、50.0和100.0 ng/mL。在上述液相色谱和质谱条件下，以MG-D5、LMG-D6和CAP-D5为内标，用仪器自带工作站按内标法进行自动计算，以峰面积与内标物峰面积比值为纵坐标Y、化合物浓度与内标物浓度比值为横坐标X，绘制标准曲线，再根据样品的峰面积响应值与内标物峰面积比值，利用标准曲线，算得样品制备液的实际测定浓度。实验结果表明，MG、LMG、CAP和 FF在质量浓度0.5～50.0 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数r在0. 999 4～0.999 9之间；TAP在质量浓度2.0～100.0 ng/mL范围内线性关系良好(r=0.999 6)，结果见表3。MG、LMG、CAP、TAP和FF的检出限(LOD)分别为 0.1、0.1、0.1、0.4和0.1 μg/kg；定量限(LOQ)分别为0.5、0.5、0.5、2.0和0.5 μg/kg。标准色谱图见图7。

表3 孔雀石绿和酰胺醇类的回归方程以及相关系数Tab.3 Regression equations and correlation coefficients of malachite green and amphenicols

图7 化合物标准色谱图
Fig.7 Chromatogram for the analytical standard

2.5 方法回收率和精密度

选取空白草鱼和南美白对虾样品，分别添加3个浓度水平的标准溶液，每个浓度水平制备6个平行样品计算添加回收率，在添加浓度范围内，孔雀石绿类和酰胺醇类抗生素的回收率在72.0%～102.6%之间，相对标准偏差为 0.9%～6.4%(表4)，为验证方法的可行性，试验还选择鲫(Carassiusauratus)、鳙(Aristichthysnobilis)、半滑舌鳎(CynoglossussemilaevisGunther)和蟹等作为空白基质进行加标回收效果试验，回收率均在70.0%～120%之间，相对标准偏差均小于 15%，因此判断本方法适合水产品基质中上述药物残留测定。

表4 样品中化合物的加标回收率及精密度Tab.4 Spiked recoveries and precisions of the analytes in samples n=6

2.6 实际样品的测定

使用本研究建立的方法用于国内市场的90个水产样品：草鱼、鲫、鳙、半滑舌鳎、南美白对虾及乌鳢(OphiocephalusargusCantor)进行分析检测，其中，2个草鱼样品中检出FF含量为8.90 μg/kg和4.75 μg/kg，其他均未检出。

3 结论

本研究建立了QuEChERS-UPLC-MS /MS法同时测定水产品中 2种孔雀石绿类和 3种酰胺醇类抗生素残留的分析方法，MG、LMG、CAP和FF在0.5～50.0 ng/mL质量浓度内有良好的线性关系，线性相关系数r大于0.999 4。MG、LMG、CAP和FF检出限为0.1 μg/kg，定量限为0.5 μg/kg，TAP素检出限为0.4 μg/kg，定量限为2.0 μg/kg。本方法灵敏、准确且简单，能满足实验室质量控制规范的技术要求。