典型贝类对一株拟菱形藻所产多莫酸毒素的蓄积差异性研究

郑关超, 吴海燕, 彭吉星, 郭萌萌, 李兆新, 李扬, 谭志军,2*

(1.农业农村部水产品质量安全检测与评价重点实验室，中国水产科学研究院黄海水产研究所；2.青岛海洋科学与技术试点国家实验室：山东 青岛 266237；3.华南师范大学生命科学学院，广州 510631)

拟菱形藻属(Pseudo-nitzschia)是一类常见的海洋浮游羽状硅藻，广泛分布于全球近岸海域，是藻神经毒素多莫酸(domoic acid，DA)的重要生物来源[1]。目前已发现52种拟菱形藻，其中26种能够产生DA，且新的物种还在不断被发现[2-3]。中国学者曾对中国沿海广泛分布的拟菱形藻进行研究，均未检测到DA。直到2017年在广东省沿海地区成功分离鉴定出1个产毒新种——伪装拟菱形藻，这是关于中国产毒拟菱形藻的第一次报道[4]。近年来，在中国沿海陆续发现了福氏拟菱形藻(Pseudo-nitzschiafukuyoi)[5]、多列拟菱形藻(Pseudo-nitzschiamultiseries)[2]等其他产毒拟菱形藻，但发现的种类仍十分有限，需要更多的相关研究。

DA可以引起人类呕吐、腹泻、腹部痉挛、头痛和头晕等症状，严重时可导致呼吸困难、癫痫发作、永久性丧失短期记忆，甚至昏迷或死亡。由于患者中毒以失忆缺失为主要症状，因此将其命名为记忆缺失性毒素。1987年加拿大爱德华地区发生了DA中毒事件，造成至少4人死亡，主要原因是食用了受污染的紫贻贝(Mytilusedulis)，其DA含量高达900 μg/g，这是首次被记录的有关DA的中毒事件[6]。随着其在全球引发的中毒事件不断增多，DA备受关注[7-8]。近年来，在中国部分海洋生物中，如牡蛎(Crassostreagigas)、扇贝(Chlamysfarreri)等也不断发现存在DA污染的情况。目前，蟹类中检测到的DA含量最高，为18.20 μg/g，其他水产品如陆蛤(8.14 μg/g)、蛤蜊(4.16、0.02及0.94 μg/g)、珍珠母(4.04 μg/g)、扇贝(5.20、10.11 μg/g)和贻贝(1.68 μg/g)等也均有检出[9-13]。虽然水产品中DA含量均低于目前国际认可的20 μg/g安全预警值[8]，但已有研究报道小鼠长期暴露于低剂量DA环境中可导致行为改变及认识缺陷[14]，孕前暴露可导致小鼠永久性神经毒性[15]。拟菱形藻属在中国沿海分布广泛，贝类极易通过自身滤食蓄积DA，并经食物链放大作用，对人类健康造成威胁，给生态和食品安全带来严峻的考验，亟需进行安全管控。因此，有针对性地科学评价贝类中DA的风险来源及控制关键点，具有重要的意义。

本研究通过将3种不同贝类品种暴露在一株产DA多列拟菱形藻(MC4181)中，初步研究了DA在不同贝类中的蓄积含量差异，分析了各组织中DA的分布情况及主要的蓄积靶器官，探讨了贝类体质量与DA蓄积含量的相关性，以期为开展中国贝类毒素调查研究提供基础数据，为系统开展贝类毒素风险防控技术提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验藻株

实验所用单克隆藻株由华南师范大学提供，为产DA多列拟菱形藻(Pseudo-nitzschiamultiseries，MC4181)，于2017年5月分离自台湾海峡。实验室内采用1 L锥形瓶，加入500～700 mL的L1培养基，放在光照强度约50～80 μmol photons/(m2·s)，光周期12 h∶12 h和温度(20±2)℃的条件下培养。每隔2～3 d取3 mL藻液，以鲁格氏液固定后进行光学显微镜镜检，以确保藻细胞生长良好。L1培养基的盐度为30，pH为8.0。

1.1.2 主要培养基及试剂

主要包括：L1培养基所用试剂均为优级纯(国药集团);乙腈(HPLC级，ThermoFisher Scientific);甲醇(HPLC级，Merk公司);甲酸(HPLC级，上海安谱);甲酸铵(HPLC级，Sigma公司);DA标准品(加拿大海洋生物研究所，CAS号14277-97-5，CRM-DA-f);强阴离子固相萃取柱(Agilent公司)。

1.1.3 仪器与设备

主要包括：TSQ Endura液相色谱-质谱联用仪(赛默飞世尔科技公司)，配有电喷雾离子源(ESI)；智能光照培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；旋涡混合器(上海安谱实验科技股份有限公司)；台式高速离心机(Neofuge 1600，上海力申科学仪器有限公司)；Milli-Q超纯水仪(Millipore公司)；固相萃取装置(Supelco公司)；超声细胞粉碎机(JY92-ⅡN，宁波新芝生物科技股份有限公司)；超低温保存箱(-80℃，Haier)；电子分析天平(德国赛多利斯公司)；超声清洗机(德国艾尔玛公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 产毒拟菱形藻的培养

使用0.45 μm孔径的混合纤维素酯膜过滤新鲜海水，于121 ℃下高温高压灭菌20 min。冷却至室温后，配制L1培养基。在5 L锥形瓶中接入产毒多列拟菱形藻，藻细胞初始接种浓度为10 000 cells/mL，按照上述培养条件进行连续扩大培养。接种后从第1天开始每隔1天(第1、3、5、7、9、11、13和15天)进行镜检计数，绘制生长曲线，以确定对数生长期时间及藻细胞浓度。

1.2.2 不同贝类的暴露实验

实验所用栉孔扇贝(Chlamysfarreri)、紫贻贝及太平洋牡蛎(Crassostreagigas)均产自青岛市胶南良种养殖场的二龄贝，经LC-MS/MS测定未受DA污染，栉孔扇贝、紫贻贝及太平洋牡蛎的平均软体部质量分别为(16.17±3.35) g、(2.84±0.83) g 及(15.26±6.52) g。实验室暂养3 d后进行实验，暂养期间不投喂饵料藻，水温(15±1)℃，24 h不间断充气。

根据预实验结果，贝类暴露实验共持续4 d，试验期间不进行取样，最后一天收取所有贝类样品。随机选取大小不一的栉孔扇贝、紫贻贝及太平洋牡蛎各60只，于3个盛有20 L海水的水槽中进行暴露实验。日换水量100%，并彻底清洗水槽中的残留物质。投喂螺旋藻粉，日投喂量为每只贝10 mg/d，投喂对数期产毒藻，日投喂量为10 000 cells/mL，暴露期间3种贝类24 h滤食藻细胞在90%以上，暴露结束后选取栉孔扇贝、紫贻贝及太平洋牡蛎各35只，测量其形态指数(整湿质量、软体部质量、壳高、壳宽和壳长)并取整个软体部。分别取15只栉孔扇贝、紫贻贝及太平洋牡蛎的软体部，分离鳃丝、内脏团、性腺、闭壳肌和外套膜共5个组织部位，保存于-80 ℃冰箱待分析。

1.2.3 毒素分析

软体部及各组织部位DA毒素含量测定参考GB5009.198—2016《食品安全国家标准 贝类中失忆性贝类毒素的测定》中液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)前处理方法，并改进液相及质谱条件。

液相色谱条件：样品分析在TSQ Endura液相色谱-质谱联用仪上进行。色谱柱为(Phenomenex C18，100.0 mm×2.1 mm×2.6 μm)，柱温35 ℃，样品室温度15 ℃，进样体积10 μL。流动相A为水(含2 mmol/L甲酸铵，加100 μL甲酸), 流动相B为100%甲醇。梯度洗脱条件: 0～1.0 min, 20% B; 1.1～3.0 min，20%～90% B; 3.1～8.0 min, 20%B。流速为0.3 mL/min。

质谱条件：采用电喷雾离子源正离子模式(ESI+)，多级反应监测(MRM), 喷雾电压3 500 V，鞘气压力为25 Arb，辅助气压力15 Arb，离子传输管温度为300 ℃，蒸发气温度为250 ℃，定量定性离子对m/z分别为 312.1/266.1、312.1/248.1，驻留时间为100 ms。

1.3 数据分析

使用游标卡尺(精确至0.01 mm)测量3种贝类形态指数，不同贝类蓄积毒素含量差异比较采用SPSS 18.0 进行统计分析，差异性分析采用Mann-Whitney U检验，相关性分析采用Spearman非参数检验，Excel 2016进行统计和作图，各分析显著性水平设置为P<0.05，极显著水平设置为P<0.01。

2 结果与分析

2.1 3种贝类各性状的表型统计量

贝类表型性状作为贝类在遗传育种及选育中重要的参考依据，对于指导实际生产具有重要现实意义，形态性状(壳长、壳高及壳宽等)和经济性状(整湿重、软体重等)一般具有显著的相关性[16-17]。本研究选取壳长、壳高、壳宽、整湿质量及软体部质量作为不同贝类的统计性状，测量所得的3种贝类的各性状的平均值、标准差及变异系数见表1。可以看出太平洋牡蛎壳长、壳宽及整湿质量最大，分别为(99.01±18.05) mm、(27.14±7.30)mm和(61.15±22.33) g，而栉孔扇贝壳高、软体部质量最大，分别为(64.66±4.84) mm、(16.17±3.35) g。从变异系数来看，太平洋牡蛎各性状的变异系数较大，说明太平洋牡蛎各性状参数离散程度较高。

2.2 3种贝类中DA毒素蓄积含量比较

采用LC-MS/MS法对3种贝类(各35只)的软体部中DA含量进行定性定量分析(图1)。已有调查研究显示，不同贝类对DA的蓄积具有显著差异性，如吉薇等[9]在南海海域调查发现栉孔扇贝中DA的蓄积含量为10.11 μg/g，而翡翠贻贝中仅为0.69 μg/g；王恒等[12]对舟山海域调查结果则显示扇贝、牡蛎、毛蚶及青蛤等不同贝类中含量范围为ND～1.68 μg/g,含量差异明显。本研究采用单细胞产毒水平为30.46 fg/cell 产DA有毒藻[18]，在实验室内对3种不同的贝类暴露4 d后发现，太平洋牡蛎蓄积平均含量为7.99 μg/kg，最大蓄积量为42.40 μg/kg，蓄积能力最强；而其他两种贝类蓄积含量相对较低，如紫贻贝中DA蓄积平均含量为2.51 μg/kg，最大蓄积量为15.49 μg/kg，栉孔扇贝中DA蓄积含量最小，平均含量仅为2.23 μg/kg。

表1 各性状的表型统计量Tab.1 Phenotypical statistics of various traits n=35

不同贝类中DA蓄积含量差异较大，具有显著差异性。太平洋牡蛎的蓄积能力均显著高于栉孔扇贝和紫贻贝(P<0.01)，而栉孔扇贝与紫贻贝蓄积能力则相近(P>0.05)。3种贝类中太平洋牡蛎的DA蓄积含量最高，约为栉孔扇贝和紫贻贝的3倍，与中国舟山等海域调查结果相近[10,12]，太平洋牡蛎对DA的蓄积能力相对于紫贻贝等要强，这可能与牡蛎消除DA的速率低于贻贝有关[19]。

图1 3种贝类中毒素蓄积含量比较
不同字母代表差异显著。
Fig.1 Comparison of toxin accumulation in three kinds of shellfishes
Different letters show significant difference.

2.3 3种贝类不同组织中DA毒素蓄积含量比较

采用LC-MS/MS法对3种贝类(各15只)各组织中DA含量进行定性定量分析(图2)，结果显示，3种贝类中内脏团、外套膜、鳃丝、性腺及闭壳肌等均具有一定DA蓄积能力，但均是内脏团的蓄积能力最高。DA的高亲和位点可能位于不同贝类组织，导致不同贝类中各组织蓄积DA的含量差异明显[19]。此外，DA摄入后不同贝类通过肠道膜转运DA的能力也不相同，而内脏中很大比例的DA是通过血液循环系统转运至其他组织[20]。本研究中，栉孔扇贝、紫贻贝及太平洋牡蛎内脏团DA蓄积含量分别为11.12、1.63和26.96 μg/kg，而其他组织中DA蓄积含量相对较低，但含量差异明显。3种贝类性腺中DA含量也较高，分别为1.45、0.37及12.31 μg/kg。鳃丝作为贝类重要的呼吸器官，其DA蓄积含量在栉孔扇贝中仅次于内脏团，为3.68 μg/kg；在太平洋牡蛎中含量也仅次于内脏团和性腺中的DA含量，为11.43 μg/kg。

水溶性贝类毒素(如DA)和麻痹性贝类毒素，代谢消除机制一般包括排泄物排出、组织交换、毒素降解或者代谢转化为无毒或毒性较小的化合物等途径[21]。本研究发现3种贝类蓄积DA的主要靶器官均为内脏团，且太平洋牡蛎中蓄积含量最高，栉孔扇贝次之，紫贻贝含量最小，这与内脏团作为主要代谢器官的事实吻合。Bogan等[22]的研究显示扇贝内脏组织中的DA蓄积含量占整个软体部的90%以上，Grimmelt等[23]的研究也表明紫贻贝内脏中大约占93%，与本研究结果相一致，均说明内脏团为贝类蓄积DA的主要器官。

栉孔扇贝中各组织蓄积DA含量的大小顺序为：内脏团>鳃丝>性腺>外套膜>闭壳肌；太平洋牡蛎中为：内脏团>性腺>鳃丝>外套膜>闭壳肌；而贻贝中则为：内脏团>闭壳肌>性腺>外套膜≈鳃丝(图2)。其他贝类毒素，如麻痹性贝类毒素、氮杂螺环酸毒素等，也发现类似的研究结果[24-25]。本研究数据显示，3种贝类的5个组织中，内脏团和性腺的含量要相对较高，为更好地保障消费者身体健康，建议食用牡蛎等贝类时尽量剔除内脏团，以降低中毒的风险。

图2 3种贝类不同组织中毒素蓄积含量比较(n=15)
Fig.2 Comparison of toxin accumulation in different tissues of three kinds of shellfishes(n=15)

2.4 3种贝类形态性状与DA蓄积含量的相关性

对3种不同贝类的性状参数与软体部中DA蓄积含量进行了相关性分析，结果表明，栉孔扇贝与太平洋牡蛎各性状参数与软体部中DA蓄积含量均没有显著相关性(P>0.05)，但在紫贻贝中发现其软体部中DA蓄积含量与壳长、壳宽、壳高、整湿质量和软体部质量等性状参数均呈现负相关性，软体部质量与DA蓄积含量相关性最大且呈显著负相关(P<0.01)(表2)。这说明个体较小的紫贻贝蓄积DA的能力要高于较大的个体，这对水产品中毒素调查以及食品安全风险评估具有重要的参考意义。类似的研究结果在牡蛎[19]、扇贝[22]中均有报道，这可能是因为小个体贝类清除速率较低而更容易蓄积DA。本研究只在紫贻贝中发现类似的结果，在其他2种贝类中未发现类似结果，可能与本次研究暴露贝类的数量较少以及时间较短有关。此外，也有相关研究显示DA蓄积含量与贻贝等个体大小不具有显著相关性[26]，因此，DA蓄积含量与贝类个体大小等性状参数的相关性还需要更多的相关研究进行验证。本研究结果对于准确阐明贝类中DA的真实风险，确保贝类产业可持续发展具有积极的科学和现实意义。

表2 紫贻贝各性状间的相关系数Tab.2 The correlation coefficients between various traits in Mytilus edulis

注：“**”代表P<0.01。

3 结论

拟菱形藻属属于沿海赤潮中细胞浓度较高的藻类[27]，是广泛分布于中国近岸水体的浮游硅藻类群。人类以及许多海洋动物，如海狮、海鸟、海獭和鲸等可通过食用浮游生物、鱼类、软体动物和磷虾等途径在体内蓄积DA。本研究发现，3种贝类中，太平洋牡蛎对DA的蓄积能力最强，3种贝类的主要蓄积靶器官均为内脏团，紫贻贝软体部质量大小与DA蓄积含量具有显著相关性。研究结果可为贝类中该毒素的污染风险评估及消费者食品安全保护提供理论基础，具有重要的现实意义。