二氢杨梅素通过Wnt/β-catenin 通路抑制肺癌干细胞的研究

陈恩就 周方联 陈 胜 郑 哲

肺癌的高度恶性生物学行为与肺癌组织中存在少量肺癌干细胞（Lung cancer stem cells，LCSCs）具有自我更新、多向分化潜能以及更强体内成瘤能力密切相关[1-2]。二氢杨梅素（DMY）是一种从美国蔓藤中提取的黄酮醇类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗菌、降压和抗血栓形成等多种药理学活性[3-4]。同时DMY还可抑制肺癌、肝癌和胃癌等多种恶性肿瘤生长，对正常细胞影响较小，但DMY 是否对恶性肿瘤干细胞发挥抗肿瘤作用尚未有文献报道[5-7]。本研究探讨DMY 体外对LCSCs 的影响及其作用机制，报道如下。

1 实验材料

1.1 细胞株 人肺癌细胞株（PC9 和H1299）以及人正常肺上皮细胞株16HBE 购于美国模式培养物保存中心（ATCC）。

1.2 药品及试剂 DMY 购自美国Sigma 公司，批号SML0295；DMEM 高葡萄糖培养基和胎牛血清购自美国Gibco 公司，批号61 870044；凋亡检测试剂盒和细胞计数-8（CCK-8）试剂盒购自上海Biyuntian公司，批号C0038；BCA 蛋白质浓度测定试剂盒和RIPA 裂解物购自北京中山生物工程有限公司，批号分别为C503061 和BDIT0037；SOX2、OCT4、ABCG2、Axin2、Survivin 抗体购自Cell Signaling 公司，批号分别为 2748、2750、42078、5863、2803；Wnt1、cyclin D、Total-LRP6、phospho-LRP6、Total-STAT3、phos－pho-STAT3（Tyr705）、phospho-STAT3（ser727）、OCT4、C-Myc、Nanog 和β-actin 抗体购自美国Santa Cruz公司，批号分别为LM14876、LM11868、LBP77206、LBP69476、LM17883、LBP86316、LBP75572、LM17473、LM11591、LM12592、LM11530。

1.3 器材与设备 3111 型CO2培养箱购自Thermo公司；RM2135 型切片机和HI1220 型烘片机购自Leica 公司；BH2 型倒置显微镜购自Olympus 公司；1681130-4B 型酶标仪、Mini-Proten Tetra System 型电泳系统购自Bio-Rad 公司。

2 实验方法

2.1 细胞培养 PC9、H1299 及16HBE 细胞均运用DMEM 培养液进行培育，同时在DMEM 培养液中添加10%胎牛血清，细胞放置细胞培养箱环境中，使用含EDTA 胰蛋白酶消化，按照1：3 的比例进行传代。PC9 和H1299 细胞转移到不含血清的MEM-F12 无酚红培养基中以提取LCSCs，培养基中添加20ng/mL的bGFG、20ng/mL 的EGF 以及20mg/mL 的B27。

2.2 配制DMY 溶液 把100mg 的DMY 添加至10mL 的DMSO 内，制备得到10mg/mL 的母液，随后妥善放置4℃环境中，临使用时将母液置于37℃水浴箱内溶解后再添加DMEM 培养基稀释成所需浓度，0.1%为DMSO 在DMY 溶液中浓度的上限，0.1%DMSO 对细胞活力无显著抑制作用。使DMY 梯度浓度为5、10、25、50、100、200μmol/L，现配现用。

2.3 CCK-8 法检测细胞活力 PC9 或H1299 细胞加入96 孔板中，每孔中分配2×104个细胞，药物处理后放在37℃环境中4h，随后将10μL 的CCK-8 试剂添加至每个96 孔板的孔中，借助酶标仪对吸光度数值（OD）进行检测和记录。

2.4 流式细胞分析细胞凋亡 将PC9 或H1299 细胞浓度设定成5×106/mL，细胞悬液通过PBS 完成3次清洗后放置在70%乙醇溶液中固定12h，离心后用PBS 液重悬细胞，在细胞中加入2.5μL annexin V试剂（20μg/mL）和50μL binding buffer 在室温下避光反应30min，再添加5μL PI 和100μL binding buffer 在室温下避光反应5min，借助流式细胞仪完成细胞凋亡检测，该步骤反复进行3 次，计算平均值。

2.5 干细胞培养 PC9 或H1299 细胞经不含血清培养基培养30 天后，在DMEM-F12 培养基中可见悬浮的干细胞球，将3 代以后的干细胞球经胰酶消化和离心后获得细胞悬液，在倒置显微镜下观察并拍摄照片。

2.6 蛋白质印迹法（Western blot）细胞在细胞裂解液的作用下提取蛋白，总蛋白离心后收集上清液（1300rpm，4℃，10min），用BCA 蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。将等量的蛋白（30g）进行十二烷基硫酸酯-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），并将其电转移到PVDF 膜上，5%的BSA 阻断硝酸纤维素膜后再通过I 抗、II 抗反应，使用增强型化学发光试剂盒完成显色、曝光等处理。

2.7 统计学方法 应用SPSS 16.0 统计软件，实验数据以均数±标准差表示，组间差异通过ANOVA 方差Dunnett-t 方法分析，设立P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 DMY 对体外PC9 和H1299 细胞活力和凋亡的影响 将依次升高浓度的DMY（5～200μmol/L）分别作用肺癌PC9 和H1299 细胞及正常肺上皮16HBE细胞24h 后，CCK-8 法测定细胞活力，结果表明，较低浓度DMY（5～100mmol/L）对体外16HBE 细胞的生长无明显抑制作用，最高浓度（200mmol/L）的DMY作用16HBE 细胞后仅使细胞存活率从100%（对照组）降低到（68.71±11.83）%，100mmol/L 的DMY 对约85%的16HBE 细胞无明显的毒性，表明浓度不超过100mmol/L 的DMY 对正常细胞生长几乎无影响，而PC9 和H1299 细胞对DMY 的敏感性明显高于16HBE 细胞。CCK-8 实验结果显示，（25～200mmol/L）DMY 可有效抑制体外肺癌细胞株PC9 和H1299活力，呈浓度依赖关系（见图1）。流式细胞术结果示，DMY（25mmol/L）作用体外肺癌PC9 和H1299细胞24h 后，可显著诱导肺癌细胞凋亡，与对照组相比较，差异有统计学意义（P＜0.01）见图2。

3.2 DMY 对体外PC9/LCSCs 和H1299/LCSCs 成球能力的影响 浓度为25μmol/L 的DMY 分别作用PC9/LCSCs 和H1299/LCSCs 24h 后，在光学显微镜下可以观察到LCSCs 的成球能力显著下降，表现为干细胞肿瘤球体积明显缩小以及细胞球数量显著减少，见图3。

3.3 DMY 抑制LCSCs 的机制 应用Western blot法测定两种LCSCs 干细胞参与自我更新转录因子（Nanog、OCT4 和SOX2）以及Wnt/β-catenin 通路相关蛋白（β-catenin、Wnt1、p-LRP6、Axin2、Survivin、cylin D、p-STAT3（Tyr705）和p-STAT3（ser727）表达量。Western blot 结果显示，DMY 显著降低PC9/LCSCs 和H1299/LCSCs 中Nanog、OCT4 和SOX2 蛋白的表达（见图4A）。DMY 作用后PC9/LCSCs 和H1299/LCSCs β-catenin、Wnt1、Axin2、Survivin 和cyclin D 表达均下调，另外DMY 作用后LCSCs 中STAT3 在Tyr705 位点的磷酸化程度减少，而DMY不影响STAT3 在Ser727 位点的磷酸化水平，见图4B。

图1 CCK-8 法测定DMY 对体外肺癌PC9 和H1299 细胞及16HBE 细胞活力的影响

图2 流式细胞术检测PC9 和H1299 细胞凋亡

图3 光学显微镜下观察PC9/LCSCs 和H1299/LCSCs 的形态注：DMY 为二氢杨梅素；DC9 为人肺癌PC9 细胞株；H1299为人肺癌H1299 细胞株；LCSCs 为肺癌干细胞

图4 Western bolt 法测定

4 讨论

本研究发现，低浓度（5～100μmol/L）的DMY 对体外16HBE 细胞生长无明显抑制作用，但PC9 和H1299 细胞对DMY 的生长抑制效应更加敏感，25μmol/L 的DMY 即可有效抑制体外PC9 和H1299细胞生长，并诱导细胞凋亡，表明DMY 对肺癌细胞的生长抑制作用是有效和安全的，与既往文献所报道的DMY 对小鼠肝脏无明显损伤作用结果相仿[7]。随后本研究分选出OCT4 及SOX2 阳性表达肺癌细胞，并经干细胞表型实验鉴定其为LCSCs。DMY 作用后可以抑制体外LCSCs 悬浮细胞球的体积和数量，同时抑制LCSCs 中干细胞标志物（Nanog、OCT4 和SOX2）的表达，这些数据有力地支持了DMY 可以作为一种有效的LCSCs 抑制剂。

许多分子信号通路有助于维持LCSCs 的特性，Wnt/β-catenin 信号通路及其下游信号因子参与细胞增殖、存活、凋亡、侵袭、血管生成、转移等多种细胞生理学过程[8-10]；Wnt 通过配体与其各自受体的相互作用介导Fzd 激活，Fzd 是导致LRP5/6 磷酸化最明确的激活因子，磷酸化LRP5/6 可提高DVL 和AXIN之间的相互作用，导致β-catenin 同源二聚并易位到细胞核，最终启动Wnt/β-catenin 信号通路靶基因的转 录，如CD44、cyclin D、c-Myc、Survivin 和fibronectin 等[11-13]。Nanog 与β-catenin 协同维持细胞多能性和自我更新，在肺癌细胞中下调Nanog 后，细胞增殖、集落形成和迁移减少[14]。鉴于Wnt/β-catenin 通路对肿瘤发生的显著作用以及LCSCs 干性维持等方面的作用，本研究探讨DMY 对LCSCs Wnt/βcatenin 信号转导的影响。Western blot 结果表明，DMY 对体内外LCSCs 中Wnt/β-catenin 信号通路具有明显抑制作用，同时减少其下游靶基因cyclin D和Survivin 表达，这可能在DMY 调节体内外肺癌细胞增殖和凋亡过程中发挥一定作用。既往研究表明，激活的β-catenin 高度参与STAT3 在基因转录和翻译水平的表达，磷酸化STAT3 进而导致β-catenin 的核转位，针对Wnt/β-catenin 通路和/或STAT3 可能消除LCSCs 表型，从而完全治愈癌症[15-16]。我们研究发现，两种肺癌干细胞STAT3 在Tyr705 位点的磷酸化程度在DMY 的作用下表达减少，而DMY 不影响STAT3 在Ser727 位点的磷酸化水平。以上结果表明DMY 可能通过Wnt/β-catenin 信号通路干预LCSCs功能。

综上所述，DMY 作为一种有效的LCSCs 抑制剂，可能通过抑制LCSCs Wnt/β-catenin 信号通路，从而发挥抗肺癌效应。