丹参二萜醌类活性成分通过PKCδ/PKD1μ 信号通路抗胰腺癌作用研究

叶晓鸥

目前，胰腺癌唯一的治愈手段为手术切除[1]，但由于患者确诊时，体内常伴有胰腺癌细胞的浸润和转移，手术切除往往无法完全根治[2]。吉西他滨配合化疗是胰腺癌的主要治疗方式，但化疗耐药会阻碍吉西他滨发挥药效[3]。在临床上丹参二萜醌类被用来治疗心血管疾病[4]，且其化合物能够诱导肿瘤细胞的凋亡[5]。本研究观察丹参二萜醌类化合物隐丹参酮、丹参新酮、去氢丹参新酮抗胰腺癌AsPC-1，BxPC-3细胞的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 胰腺癌AsPC-1 细胞、BxPC-3 细胞均采购于中科院上海细胞所。隐丹参酮（cryptotanshinone，CPT）分子式为C19H20O3，相对分子质量296.35，采购于Selleck（中国上海蓝木化工有限公司）（批次S 228502）。丹参新酮（miltirone）分子式为C19H22O2，相对分子质量282.382，由浙江省中医院中心实验室尹一飞老师馈赠。去氢丹参新酮（dehydromiltirone）分子式为C19H20O2，相对分子质量280.367，由浙江省中医院中心实验室尹一飞老师馈赠。

1.2 细胞培养 胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 细胞用含10% gibco 胎牛血清RPMI1640 培养液，置于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中常规培养。

1.3 CCK-8 法检测细胞增殖能力 常规培养胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 细胞，并按照不同浓度的隐丹参酮（0、5、10、15、30、50μM）、丹参新酮（0、5、10、15、20、30μM）、去氢丹参新酮（0、5、10、15、20、30μM）分别进行处理。加入CCK-8 并在培养箱中孵育后，检测吸光度值（OD 值），并计算细胞存活率。

1.4 PI/Annexin-V 流式细胞术检测细胞凋亡 按照AsPC-1 组和BxPC-3 组进行分组，组内分别设置有空白对照组、隐丹参酮组（30μM）、丹参新酮组（15μM）、去氢丹参新酮组（15μM），分别作用于对数生长期的胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 细胞24h，经AnnexinV-FITC/PI 染色后，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.5 Western blot 检测PKC 同工酶磷酸化 隐丹参酮组（30μM）和空白对照组；丹参新酮组（15μM）和空白对照组；去氢丹参新酮组（15μM）和空白对照组分别作用于对数生长期的胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3细胞4h 后，收集细胞提取细胞总蛋白Western blot检测PKC 信号通路相关位点的磷酸化水平。

1.6 SiRNA 转染 对AsPC-1 和BxPC-3 细胞进行siRNA 转染，以沉默PKCδ。转染后siRNA 的阴性对照组为si-nc 组，成功沉默PKCδ thr505 位点的细胞设置为siRNA 组，并将未经任何处理的的细胞设置为空白组（con）。按照上述分组分别将处于对数期的细胞接种于6 孔板中于细胞培养箱中培养4h 后，收集细胞提取细胞总蛋白Western bloting 法检测PKCδ thr505、PKD1 ser744/748 位点的磷酸化情况。

1.7 统计学方法 应用SPSS 19.0 统计软件进行数据分析，实验数据以均数±标准差表示，采用单因素方差分析及Dunnett t 检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 隐丹参酮、丹参新酮、去氢丹参新酮显著抑制胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 细胞增殖 不同浓度的隐丹参酮（0、5、10、15、30、50μM）、丹参新酮（0、5、10、15、20、30μM）、去氢丹参新酮（0、5、10、15、20、30μM）作用对数生长期的胰腺癌AsPC-1、BxPC-3、Panc-1、MIAPaCa-2 细胞24h 后CCK-8 法检测细胞存活率。结果显示，隐丹参酮浓度为30μM 时AsPC-1 细胞存活率为（40.1±5.0）%，BxPC-3 细胞存活率为（36.2±5.4）%，Panc-1 细胞存活率为（89.3±6.5）%，MIAPaCa-2 细胞存活率为（92.2±4.9）%；丹参新酮浓度为15μM 时AsPC-1 细胞存活率为（52.1±5.1）%，BxPC-3 细胞存活率为（47.2±5.7）%，Panc-1 细胞存活率为（95.3±5.5）%，MIAPaCa-2 细胞存活率为（93.2±5.9）%；去氢丹参新酮为15μM 时AsPC-1 细胞存活率为（46.1±5.0）%，BxPC-3 细胞存活率为（42.2±5.4）%，Panc-1 细胞存活率为（92.3±4.8）%，MIAPaCa-2 细胞存活率为（91.2±4.3）%。上述实验结果表明，隐丹参酮、丹参新酮、去氢丹参新酮对As－PC-1、BxPC-3 细胞增殖有明显的抑制作用，且呈浓度及时间依赖性（P＜0.01）。

2.2 隐丹参酮、丹参新酮、去氢丹参新酮显著促进胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 细胞凋亡发生 按照As－PC-1 组和BxPC-3 组进行分组，组内分别设置有空白对照组、隐丹参酮组（30μM）、丹参新酮组（15μM）、去氢丹参新酮组（15μM），分别作用于对数生长期的胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 细胞24h，经AnnexinV-FITC/PI 染色后，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果显示，空白对照组、隐丹参酮组、丹参新酮组、去氢丹参新酮组分别作用于对数生长期的胰腺癌AsPC-1 细胞24h，细胞的凋亡率分别为（4.6±3.4）%、（29.1±4.6）%、（50.3±7.1）%、（41.2±4.3）%；空白对照组、隐丹参酮组、丹参新酮组、去氢丹参新酮组分别作用于对数生长期的胰腺癌BxPC-3 细胞24h，细胞凋亡率分别为（5.3±4.8）%、（29.5±4.2）%、（32.1±5.4）%、（51.9±4.5）%。上述实验结果表明，相对于空白对照组，隐丹参酮组、丹参新酮、去氢丹参新酮均能显著促进胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 细胞凋亡发生，且差异有显著统计学意义（P＜0.01）。

2.3 隐丹参酮、丹参新酮、去氢丹参新酮显著抑制胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 细胞PKD1 ser916、PKCδ thr505、PKD1 ser744/748 位点的磷酸化 隐丹参酮组（30μM）和空白对照组；丹参新酮组（15μM）和空白对照组；去氢丹参新酮组（15μM）和空白对照组分别作用于对数生长期的胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3细胞4h 后，收集细胞提取细胞总蛋白Western blot法检测PKC 信号通路相关位点的磷酸化水平。结果显示，隐丹参酮组、丹参新酮组、去氢丹参新酮组PKD1 ser916、PKCδ thr505、PKD1 ser744/748 位点的磷酸化水平均下调，其它PKC 蛋白磷酸化水平未发生明显变化（见图1）。

2.4 隐丹参酮、丹参新酮、去氢丹参新酮均能在1h内显著抑制胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 细胞PKCδ thr505、PKD1 ser744/748 位点磷酸化 隐丹参酮组（30μM）、丹参新酮组（15μM）、去氢丹参新酮组（15μM）分别按照0、30min、1、2、4h 的时间梯度作用于对数生长期的胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 细胞，收集细胞提取细胞总蛋白Western blot 法检测PKCδ thr505、PKD1 ser744/748 位点的磷酸化情况。结果显示，隐丹参酮下调AsPC-1 细胞PKCδ thr505、PKD1 ser744/748 位点磷酸化在作用2h 后效果显著，对BxPC-3 细胞p-PKCδ thr505、p-PKD1 ser744/748 的下调作用则在30min～1h 时有明显效果；丹参新酮、去氢丹参新酮则均能在1h 显著抑制胰腺癌AsPC-1和BxPC-3 细胞PKCδ thr505、PKD1 ser744/748 位点磷酸化（见图2）。

2.5 SiRNA 沉默处理胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 细胞PKCδ 后，PKD1 ser744/748 位点磷酸化水平明显下调 对AsPC-1 和BxPC-3 细胞进行siRNA 转染，以沉默PKCδ。转染后siRNA 的阴性对照组为si-nc组，成功沉默PKCδ thr505 位点的细胞设置为siRNA 组，并将未经任何处理的细胞设置为空白组（con）。按照上述分组分别将处于对数期的细胞接种于6 孔板中于细胞培养箱中培养4h 后，收集细胞提取细胞总蛋白Western bloting 法检测PKCδ thr505、PKD1 ser744/748 位点的磷酸化水平。结果显示，siRNA 沉默胰腺癌AsPC-1、BxPC-3 细胞PKCδ 后，胰腺癌AsPC-1、BxPC-3 细胞PKD/PKCμ ser744/748 的磷酸化水平下调（见图3）。

图1 Western blot 实验检测PKC 相关位点磷酸化水平

图2 Western blot 检测PKCδ 和PKD1 磷酸化水平

图3 Western blot 检测经过siRNA 转染后AsPC-1、BxPC-3细胞PKC 相关位点磷酸化水平

3 讨论

蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）是一组由单一多肽链组成的磷脂依赖性Ca2+激活的蛋白丝氨酸/苏氨酸。前期实验和文献调研发现，PKC 在调控细胞增殖、分化、凋亡以及血管形成等诸多方面都起到重要作用，研究表明，PKC 能够被具有促肿瘤增殖作用的佛波脂所激活，提示PKC 在肿瘤的增殖过程中可能起重要作用，因此被认为可能是肿瘤治疗中的一个新靶点[6]。研究表明，PKCδ 特异性抑制剂能显著性抑制胰腺癌Panc-l 和结肠癌HT29 细胞的肿瘤再增殖；PKCα 调节的肝癌细胞、乳腺癌细胞的侵袭转移能力通过p38 信号通路介导[7]；PKCβII 选择性抑制剂betalIV5-3 能够减少人前列腺癌内皮细胞增殖和血管生成[8]；而PKCδ 的激活则引起促进肿瘤形成的SHH 信号通路及非经典的Writ 信号通路的活化[9]。

文献报道，PKD/PKCμ SER916 位点可以作为监测PKD 活性的指标[10]，当p-PKD/PKCμ SER916 的表达受到抑制时，p-PKCδ thr505/p-PKD1 ser744/748 的表达会同时受到抑制。实验结果显示，隐丹参酮（30μM）、丹参新酮（15μM）、去氢丹参新酮（15μM）分别作用于胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 细胞24h 后，p-PKD1 SER916 的水平均有下调，以此推测p-PKCδ thr505/p-PKD1 ser744/748 信号通路在该过程中发挥作用。后续实验证明，p-PKCδ 水平受到抑制，并因此下调PKD1 ser744/748 的磷酸化。

综上所述，隐丹参酮、丹参新酮、去氢丹参新酮均能抑制p-PKCδ thr505 的表达，继而p-PKD/PKCμ ser744/748 表达下调，从而显著促进胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 细胞凋亡发生。已有文献报道PKD1 ser744/748 的磷酸化可以调控JNK 信号通路[11]，因此推测隐丹参酮、丹参新酮、去氢丹参新酮通过调控PKD1-JNK 信号通路，抑制胰腺癌AsPC-1 和Bx－PC-3 细胞的增殖。