星点设计-效应面优化法优选全蝎刚毛显微特征常数测定条件

王迎夏,杨涛,彭振瑜,张静伟,刘孟瑜,陈聪慧

(临沂大学药学院，山东 临沂 276000)

全蝎，中药名，为钳蝎科动物东亚钳蝎(ButhusmartensiiKarsch)的干燥体，辛，有毒。具有熄风镇痉、攻毒散结、通络止痛之功效。《中国药典》2015年版收录性状：本品头胸部与前腹部呈扁平长椭圆形，后腹部呈尾状，皱缩弯曲，完整者体长约6 cm。头胸部呈绿褐色，前面有1对短小的螯肢和1对较长大的钳状脚须，形似蟹螯，背面覆有梯形背腹面有足4对，均为7节，末端各具2爪钩；前腹部由7节组成，第7节色深，背甲上有5条隆脊线。背面绿褐色，后腹部棕黄色，6节，节上均有纵沟，末节有锐钩状毒刺，毒刺下方无距。气微腥，味咸。全蝎粉末呈淡黄色至棕黄色，微腥。刚毛呈棕黄色，完整或短碎存在，靠近基部呈淡黄白色至白色变化，较平直，近基部稍膨大，毛干具有明显的直线型纵向纹理。可于光学显微镜10倍镜下观察，具有生物学稳定特征，易于观察计数(见图1)。主产于河南、山东、河北、辽宁等地。

目前国内多采取正交设计或均匀设计法优化显微常数测定条件[1-4]，这两种方法多采用线性数学模型，虽有简便、试验次数较少等优点，但精度不太高。星点设计是在析因设计的基础上，加上星点及中心点而形成的试验设计方法，该法采用非线性数学模型拟合，复相关系数较高，在中心点进行重复性试验以提高试验精度，预测值更接近真实值且简便，试验次数较少[5-8]。本试验以显微常数RSD值为指标，引入星点试验设计方法，结合效应面法优选全蝎刚毛显微常数测定条件，旨在优化全蝎刚毛显微特征常数测定条件的同时，为探讨该试验设计法进一步应用优选全蝎刚毛显微特征常数测定条件可行性提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 ME104万分之一电子分析天平(深圳市盛美仪器有限公司)；Olympus CX-41生物显微镜(日本奥林巴斯公司)；KQ3200DV超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；QE-100高速中药粉碎机(浙江屹立工贸有限公司)。

1.2 材料 甘油、水合氯醛(天津市瑞金特化学品有限公司)均为分析纯；试验用水合氯醛试液均按照《中国药典》2015年版(一部)附录配置。

全蝎来源于临沂市各大药房，因来源不同各个药店的全蝎质量均有略微差异。所有试验样品经临沂大学天然药物化学教研室陈聪慧老师鉴定为全蝎正品。具体来源见表1。

表1 全蝎样品信息

2 方法与结果

2.1 载玻片试液体积的选择 精选完整的大小接近的优质全蝎在磨药器中充分研磨0.5 min，然后过80目筛得到全蝎粉末,根据表3分别精密称取全蝎粉末9份，用水合氯醛试液多次水飞，移入25 mL容量瓶，根据表3加入不同量的甘油，最后用水合氯醛试液定容混匀。用移液枪吸取试液滴到载玻片上，用盖玻片盖住测出不同条件的试液完全被盖玻片所覆盖同时又不溢出时的体积求得平均值。以平均值作为移液枪吸取的体积。经过试验，选定0.04 mL为每张玻片所用样品试液的最适体积。

2.2 目筛的筛选 根据分析得到影响显微常数的3个因素为甘油量、全蝎的质量、目筛的大小，因为星点设计需要的是连续的变量，所以目筛的大小在做星点设计之前需要筛选出来，通过固定其他两个因素不变，改变目筛的选择，做预试验选出需要的目筛。分别称取过65目筛、80目筛、100目筛的全蝎粉末500 mg加水合氯醛试液少量水飞，移入25 mL容量瓶，加10 mL甘油，用水合氯醛试液定容充分摇匀，分别取0.04 mL进行显微装片，每份样品溶液平行装片30张，观察刚毛个数并记录。测出每份样品的RSD值，试验结果见表2，选出目筛为65目。

表2 各目筛混匀度RSD值

2.3 星点设计-效应面优化法条件优化设计 根据文献报道及显微常数的测定方法[9-13]，确定显微常数测定条件的考察因素为全蝎粉末量、甘油量、目筛的大小。由于目筛为非连续变量，回归处理较困难，结合预试验结果定为 65目筛，其余因素的水平据预试验结果而定，全蝎的质量范围为100～700 mg,甘油的体积范围为2～10 mL以全蝎刚毛个数的RSD值为考察指标，采用星点设计优化显微常数测定条件，水平取值为0、±1、±λ，λ=(F)1/4，F为析因设计部分试验次数，F=k2(k为因素数)或者F=k2×(1/2)(一般5因素以上采用)，因素水平见表3，试验安排见表4。

表3 测定条件星点设计因素水平

表4 测定条件星点试验设计与结果

根据表3取老百姓大药房全蝎粉末共13份，用水合氯醛试液多次水飞，移入25 mL容量瓶，依据表3加入不同量甘油，用试验用水合氯醛试液定容，充分摇匀后，精密吸取0.04 mL进行装片，每份样品平行装片30张，于显微镜下观察并记录刚毛数，求其RSD值，将试验数据用SPSS 19.0和OriginPro 9.1进行二元线性及非线性拟合做数据对比画出函数三维图分析优化全蝎刚毛显微特征常数测定条件，根据条件求出全蝎刚毛显微特征常数值。

2.3.1 二元线性分析 结果用SPSS 19.0输入数据处理得到由二元线性分析得到函数关系式：Y=-0.025X1+0.219X2+30.878，R2=0.347，P=0.118(P>0.05)，拟合度很差且显著性不好。

2.3.2 二元非线性拟合 结果用OriginPro 9.1进行二元非线性拟合，剔除相关性差的组分，再次进行二元非线性拟合，得到结果函数关系式为Y=38.894 68-0.025 04X1-4.366 57X2+0.000 025 308 6X12+0.379 86X2-0.000 503 808X1X2，R2=0.753 45，P=0.000 098(P<0.01)(X1代表全蝎用量、X2代表甘油量)，拟合度较好，显著性高。

2.3.3 响应曲面图 用OriginPro 9.1软件绘制二次多项式模型中两因素对评价指标RSD的三维效应曲面图(见图2)，可直观地反映各因素的交互作用对响应值的影响，有助于确定最佳显微常数测定条件范围。

2.3.4 条件优化与预测因变量 曲面图是三维图，能表达含两个自变量的函数，基于已建立的函数模型，对全蝎的显微特征常数测定条件进行最优化设计，为使试验设计结果Y值(RSD值)最小，可得到当全蝎用量为556 mg，甘油量为5.8 mL时，混匀度最好，RSD最低值为18.586 5%，最终选取优化条件为全蝎556 mg,甘油量为6 mL。

2.4 验证试验 为了确定建立的模型与试验结果是否相符，通过进一步试验对结果模型可靠性进行验证，验证试验中各因素的取值为上述的优化条件，分别对5家药店的全蝎进行试验测定，得到结果见表5。将得到的值与预测值做比较，偏差结果见表6。

表5 全蝎中刚毛数值测定的星点设计验证试验结果

表6 各全蝎样品优化条件结果与预测值偏差

结果表明,实际值与预测值偏差较小，说明模型可靠，用效应面法来优化全蝎的刚毛显微特征常数测定条件是可行的。

2.5 全蝎各样品刚毛显微特征常数值测定 按照设计结果分别精密称取全蝎5种样品粉末，水合氯醛试液多次水飞，移入25 mL容量瓶中，加入优化甘油量，用水合氯醛试液定容摇匀。精密吸取溶液0.04 mL，分别平行装片30张，观察刚毛并计数，按公式(1)计算全蝎刚毛显微特征常数值(P)，结果见表7。

P=(X × V)/(V′× W)

(1)

式中：W-样品质量(mg)；V-定量样品混悬液总体积(mL)；P-定量样品显微特征常数值(个/mg)；V′-盖玻片下样品混悬液体积(mL)；X-每片盖玻片下样品显微刚毛数。

表7 各全蝎样品刚毛显微特征常数数值测定结果

3 结论与讨论

本试验采用556 mg的全蝎粉末，6 mL的甘油量对全蝎的刚毛显微特征常数进行测定，结果精确度、稳定性、重复性好。对显微常数的测定常用的正交设计与均匀设计，这两种方法试验次数少，操作简便，但是得到的结果精确度不高，建立的数学模型预测性差，难以全面反映自变量与因变量之间的相关性，本试验采用星点设计效应面优化法优化全蝎刚毛的显微常数测定条件，得到的结果与预测值非常接近，混匀度高，说明采用星点设计建立的数学模型优化显微常数测定条件是可行的，对于目筛的选用是显微常数测定的因素之一，因为为非连续变量，所以在采用星点设计前，先通过确定其他因素不变改变目筛得到混匀度结果最好的目筛来进行下面的星点设计。