补肾填精益髓法对脑出血模型大鼠神经保护作用及Notch-1蛋白表达的影响

张 毅，魏绪旺，许 康，张 昭，薛瑶瑶，范天祥

脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)后大量神经细胞凋亡是造成ICH后神经功能障碍的根本原因[1]。目前修复神经方面的药物多为脑源性神经营养因子，只能保护未受损的神经细胞，缺少直接促进神经干细胞(neural stem cells，NSCs)增殖的药物。研究证实，海马区存在NSCs，ICH后海马区域产生的新生神经元可以迁移到脑损伤区域，有效改善神经功能缺损[2]。而海马区神经发生的过程主要包括NSCs的增殖、分化以及迁移，这一过程受到Notch信号的调控，Notch信号通路在脑损伤时被激活，参与ICH后的神经再生与修复过程[3]。补肾填精益髓方源于刘完素《黄帝素问宣明论方》中的地黄饮子，研究证实地黄饮子能够促进NSCs增殖分化，并改善其神经功能[4-5]。因此，本实验通过建立ICH大鼠模型，基于Notch信号通路灌服补肾填精益髓方，观察ICH大鼠Bederson神经功能评分、5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)/神经元核抗原(NeuN)阳性细胞数、Notch-1蛋白表达变化，探讨补肾填精益髓法对ICH大鼠的神经保护作用及Notch-1蛋白表达的影响，明确其具体作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 实验用健康SD大鼠126只，体重200～250 g，动物许可证号：SCXK，陕2017-003，购自西安交通大学实验动物中心，饲养于陕西中医药大学药学院实验中心动物房，室温度维持在22 ℃左右，室内湿度维持在30%～40%。

1.2 实验药物 10%水合氯醛(上海运佳黄埔制药)、0.5%碘伏消毒液(规格为每瓶100 mL)、单唾酸神经节苷脂注射液(北京赛升药业股份有限公司)、0.9%氯化钠注射液(广东艾希德药业有限公司)、γ-分泌酶抑制剂(DAPT，武汉博士德生物工程有限公司)。补肾填精益髓方组成：熟地黄15 g，山茱萸15 g，肉苁蓉10 g，巴戟天10 g，炮附子6 g，肉桂12 g，石斛12 g，麦冬12 g，石菖蒲10 g，远志10 g，茯苓10 g，生姜3片，大枣5枚。由陕西中医药大学附属医院药剂室提供，符合2015年版《中国药典》规范，按人与动物体重剂量折算表进行浓缩，煎药浓缩成生药浓度为1.54 g/mL，4 ℃冰箱保存备用。

1.3 实验试剂 Anti-β-catenin抗体(ABCAM公司)、多聚体抗兔IgG-HRP(ABCAM公司)、免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)、Notch-1抗体(武汉博士德生物工程有限公司)、BrdU抗体(武汉博士德生物工程有限公司)、Anti-NeuN Antibody(武汉博士德生物工程有限公司)、正常山羊血清(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.4 实验仪器 转轮式切片机(深圳永年科技公司)，TSJ-Ⅱ型全自动封闭式组织脱水机(仪征市康福医疗器材有限公司)、BMJ-Ⅲ型包埋机(上海珂淮仪器有限公司)，PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪(型号：XLCU-PHY-Ⅲ库号)，数码三目摄像显微镜(BA400Digital，麦克奥迪实业集团有限公司)，图像分析软件Image-Pro Plus6.0(美国Media Cybernetics公司)。

1.5 方法

1.5.1 ICH大鼠动物模型的建立 参考韩佳炜等[6]ICH大鼠模型制作技巧，采用自体尾动脉血注血法制作ICH模型。用10%水合氯醛以0.3 mL/100 g腹腔麻醉大鼠，仰卧固定在立体定位仪上，使大鼠的前后囟处于同一水平；沿头皮正中切一长约10 mm切口，参照大鼠立体定位图谱，定位前囟前0.2 mm，中线右偏3 mm，微量注射器垂直进针约5.5 mm，到达右侧大鼠尾壳核区，小型牙科钻颅骨穿透至硬脑膜处；尾动脉抽取非肝素抗凝自体动脉血进针至尾状核区，缓慢注入50 μL，2 min内匀速注入，缓慢将注射器完全退出，局部医用骨蜡封闭，皮肤缝合，尾部切口加压包扎，创伤处用碘伏消毒，并喷以青霉素以防感染。假手术组只做刺入动作，不穿透硬脑膜，不向脑内注血，余同对照组。

1.5.2 分组及给药方法 取造模成功大鼠120只，随机分为假手术组、模型组、神经节苷脂组、补肾填精益髓组、DAPT组，另设空白组6只，作为参照，总共126只。各组均于造模后次日灌胃。补肾填精益髓组：以补肾填精益髓方汤剂按1.54 mL/(kg·d)灌胃，每日2次，连续给药28 d；神经节苷脂组：按30 mg/(kg·d)给予神经节苷脂注射液；模型组、假手术组：给予等体积无菌蒸馏水，自由饮食、活动； DAPT组：造模成功后，腹腔注射DAPT 10 mg/(kg·d)。各组分别在第3天、第7天、第14天、第28天4个时间点处死大鼠，在处死大鼠前24 h，腹腔注射BrdU 50 mg/(kg·d)，之后处死动物取材。

1.5.3 切片制作、尼氏染色、免疫组化检测 于造模后第3天、第7天、第14天、第28天将每组BrdU标记的6只大鼠进行处死，4%多聚甲醛灌注取脑，冰冻切片机连续冠状切片，切片厚18 μm。取大脑左侧海马组织平面，胰蛋白酶修复15 min，2 mol/L的HCl 37 ℃孵育30 min，5%羊血清室温封闭30 min，加入Rabbi Anti-NeuN antibody(1∶100)，Rabbit Anti-Neun antibody(1∶100)，4 ℃冰箱孵育过夜，复温30 min，磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗5 min×3次，免疫组化检测严格按照试剂盒说明操作，每张切片随机选取海马区5个400倍高倍镜视野，NeuN共染色双标阳性细胞，代表了新生NSCs，记录BrdU/NeuN阳性细胞数。

1.5.4 Bederson神经功能评分及Notch-1蛋白表达 分别在造模成功后第3天、第7天、第14天、第28天进行Bederson神经功能评分[7]，采用Werstern Bcot法测定Notch-1蛋白表达。

2 结 果

2.1 病理学改变 模型组细胞坏死程度最严重，可见大部分细胞坏死、溶解、核浓缩，坏死细胞融合，边界不清；补肾填精益髓组、神经节苷脂组较模型组、DAPT组细胞坏死程度轻，神经节苷脂组可见部分细胞核固缩，少量细胞核溶解，胞质液化，边界较模糊；补肾填精益髓组细胞核完整，胞质淡染，核仁清晰，细胞与间质界限清楚。详见图1。

注：①为假手术组；②为模型组第7天；③为模型组第14天；④为神经节苷脂组第7天；⑤为神经节苷脂组第14天；⑥为补肾填精益髓组第7天；⑦为补肾填精益髓组第14天；⑧为DAPT组第7天；⑨为DAPT组第14天。各用药组在第7天、第14天最典型，所以切片图取第7天、第14天结果。

2.2 BrdU/NeuN双标阳性细胞数比较 术后各时间点，模型组、假手术组、DAPT组大鼠海马区均可见BrdU/NeuN双标阳性细胞表达，但组间差异无统计学意义(P>0.05)。术后第7天、第14天、第28天，补肾填精益髓组BrdU/NeuN双标阳性细胞数均高于假手术组、模型组、神经节苷脂组和DAPT组(P<0.01)；神经节苷脂组BrdU/NeuN双标阳性细胞数均高于模型组和DAPT组(P<0.01)，低于假手术组(P>0.05)；而在术后第7天、第14天，补肾填精益髓组BrdU/NeuN 双标阳性细胞数高于神经节苷脂组，且达到高峰(P<0.01)，随后均呈下降趋势。详见图2、表1。

注：①为假手术组；②为模型组第7天；③为模型组第14天；④为神经节苷脂组第7天；⑤为神经节苷脂组第14天；⑥为补肾填精益髓组第7天；⑦为补肾填精益髓组第14天；⑧为DAPT组第7天；⑨为DAPT组第14天。各用药组在第7天、第14天最典型，所以切片图取第7天、第14天结果。

表1 各组ICH大鼠海马区BrdU/Neun表达(±s)

与假手术组比较，①P<0.01；与模型组比较，②P<0.01；与DAPT组比较，③P<0.01；与神经节苷脂组比较，④P<0.01；与同组第3天时比较，⑤P<0.01。

2.3 Bederson神经功能评分 假手术组各时间点Bederson神经功能评分均为0分；DAPT组各时间点Bederson神经功能评分比较差异均无统计学意义(P>0.05)；模型组在第14天、第28天Bederson神经功能评分低于第3天、第7天，差异均有统计学意义(P<0.01)；术后第7天、第14天、第28天，补肾填精益髓组、神经节苷脂组Bederson评分均低于第3天，差异均有统计学意义(P<0.01)。术后第7天、第14天，补肾填精益髓组大鼠Bederson神经功能评分较模型组、神经节苷脂组、DAPT组改善明显(P<0.01)，至术后第28天Bederson神经功能评分基本降至正常。详见表2。

表2 各组Bederson神经功能评分比较(±s) 单位：分

与模型组比较，①P<0.01；与DAPT组比较，②P<0.01；与神经节苷脂组比较，③P<0.01；与同组第3天时比较，④P<0.01；与同组第7天时比较，⑤P<0.01。

2.4 各组大鼠海马区出血灶周围Notch-1蛋白表达 术后各时间，模型组、假手术组、DAPT组大鼠海马区均可见Notch-1蛋白表达，但组间差异无统计学意义(P>0.05)。术后第7天、第14天、第28天，补肾填精益髓组、神经节苷脂组、DAPT组Notch-1蛋白表达均高于模型组和假手术组(P<0.01)；而在术后第7天、第14天，补肾填精益髓组Notch-1蛋白表达高于神经节苷脂组，且达到高峰(P<0.01)，随后均呈下降趋势。详见表3、图3。

表3 各组大鼠海马区出血灶周围Notch-1蛋白表达(±s)

与假手术组比较，①P<0.01；与模型组比较，②P<0.01；与DAPT组比较，③P<0.01；与神经节苷脂组比较，④P<0.01；与同组第3天时比较，⑤P<0.01。

图3 ICH大鼠海马区Notch-1蛋白表达

3 讨 论

ICH后大量神经细胞受损带来神经功能缺损和病人死亡，给病人家庭及社会带来了沉重负担。如何减轻出血后继发性脑损害是ICH治疗的根本。目前出血性脑卒中主要的病理损害为血肿灶周围凝血酶原释放大量的炎性因子引起脑组织肿胀，导致继发性神经元损伤[8]。因此，ICH的治疗重点在于促进血肿吸收、降低血肿灶周围的炎性水平、降低神经细胞损伤、恢复脑功能。在治疗过程中如何恢复大脑神经元和最大限度地挽救脑细胞，恢复脑组织功能是目前研究的重点。

Notch信号通路首次由Ronald从胎鼠中提取出了NSCs，后来被证实可以调控NSCs的增殖与分化，Notch主要表达在胚胎期和成年期小鼠大脑的海马区和室管膜区。研究提示，当活化Notch信号后，可以有效地促进小鼠海马NSCs的增殖。而当Notch信号被外界因素干预受到抑制后，海马中的NSCs数量明显会降低[9]。在正常生理状态下，Notch信号通路靶基因Notch蛋白始终恒定在相对稳定的表达水平，维持NSCs的数量。在病理环境下(如衰老、脑卒中、脑损伤)均会影响Notch的表达水平，进而影响NSCs的数量和海马神经发生[10]。Notch主要是通过调控NSCs的分裂方式来决定NSCs的命运。当Notch信号通路下端NICD的靶基因Notch-1蛋白过表达，NSCs水平分裂的能力也明显增高，促进机体组织内的NSCs数量保持稳定和促进新的NSCs产生[11]。DAPT是Notch信号通路抑制剂，研究证实当DAPT抑制了Notch信号通路后损伤灶周诱导的Notch1和Hes1表达以及细胞增殖显著下降，ICH灶周围NSCs增殖明显减少，神经损伤症状改善不明显[12]。

补肾填精益髓方源于地黄饮子，属于滋补肾阴、补肾助阳开窍化痰之剂，对中风舌强喑痱、肢体偏瘫、痰多难咳具有很好的效果。古代医家刘完素认为中风之喑痱证主要是因肾精不足、肾气亏损之足废不能用，喑痱不能言。此方从古至今一直是治疗中风之名方，已取得了较好的临床效果。前期研究表明，地黄饮子不但可以改善大鼠记忆力、延缓衰老、抑制氧化损伤，保护神经功能，而且可以促进NSCs增殖，特别是在治疗中风、阿尔茨海默病方面具有很好的临床效果[4]。现代药理学研究表明，熟地黄、肉苁蓉、巴戟天等提取物均有抗氧化、延缓衰老、改善记忆力、保护神经细胞等作用，其作用机制为通过提高病理组织区域的BDNF的表达，抑制Bax的过表达和降低Bcl-2表达，保护神经细胞，减少神经细胞凋亡[13-14]。

本实验研究结果显示，在预定的时间段给予补肾填精益髓方灌胃，能提高大鼠ICH灶周围NSCs的数量。第7天、第14天时，NSCs数量达到高峰，随后呈下降趋势。其中补肾填精益髓组NSCs数量增加最明显；补肾填精益髓组NSCs数量高于神经节苷脂组。各组各时间点均可见Notch-1蛋白表达，补肾填精益髓组和神经节苷脂组Notch-1蛋白表达增加最显著；且补肾填精益髓组较神经节苷脂组Notch-1蛋白表达更显著。从病理结果来看，补肾填精益髓组、神经节苷脂组细胞坏死程度较模型组、DAPT组轻，神经节苷脂组可见部分细胞核固缩，少量细胞核溶解，胞质液化，边界较模糊；补肾填精益髓组细胞核完整，胞质淡染，核仁清晰，细胞与间质界限清楚。说明补肾填精益髓法促进ICH大鼠内源性NSCs增殖并可以改善ICH大鼠神经功能，其机制可能与Notch信号通路调控其下游靶基因Notch-1蛋白上调有关。本实验通过DAPT抑制Notch信号通路后NSCs及Notch-1蛋白表达不显著，且BrdU/Neun阳性细胞数增长均不显著，通过对比DAPT组及神经节苷脂组进一步印证了补肾填精益髓法促进ICH大鼠内源性NSCs增殖，并且其促进NSCs增殖过程中有Notch信号通路介导。研究证实神经节苷脂可以促进外源性NSCs增殖分化，神经节苷脂可以有效保护脑神经，改善其神经功能缺损症状[15]。但从本实验结果来看，神经节苷脂在促进内源性NSCs增殖分化方面并不显著，但可以在一定程度上改善ICH大鼠神经功能，其作用机制还需进一步研究。

综上所述，补肾填精益髓法能够促进ICH大鼠神经细胞再生，其作用机制可能与补肾填精益髓方诱导Notch信号通路NICD下游靶基因Notch-1蛋白表达有关。