一株具有烟草甲幼虫毒杀作用苏云金芽孢杆菌的遗传多样性分析及cry基因鉴定

胡逸超，雷 薇，孙建生，李季刚，邹克兴，苏 赞，梁 伟，蔡联合，陈 琦，邹承武

(1.广西中烟工业有限责任公司技术中心，广西 南宁 530001；2.南宁国拓生物科技有限公司，广西 南宁 530001；3.广西大学农学院，广西 南宁 530004)

【研究意义】苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)在产生芽孢过程中会产生具有生物杀虫活性的δ-内毒素(ICPs)或cry蛋白(crystal toxcin protein)[1]，这些毒素对范围较广的昆虫具有毒杀作用，且具有较高的特异性，对环境及非靶标生物安全，目前已广泛用于控制农林害虫[2]。已有研究表明，苏云金芽孢杆菌属于蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus，Bc)群，包含6个非常相近的种(B.cereus、B.anthracis、B.mycoides、B.pseudomycoides、B.weihеnstephanensis和B.thuringiensis)[3]，而细菌的经典生物化学和形态学分类方法一直未能区分苏云金芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌[4]，制约了苏云金芽孢杆菌在农业和医学上的应用。因此，分析苏云金芽孢杆菌在关键基因序列上的遗传多样性并进行详细分类，对该菌株所携带的cry基因类型进行检测及其在农业上的开发应用具有重要意义。【前人研究进展】Bavykin等[5]研究认为，基于对表型性状的原核生物分类学有较大局限性，16SrRNA的基因序列是目前分析原核生物系统发育最广泛应用的基因，其对rRNA序列的分析已经使人们对原核生物多样性知识有了深刻了解。Yamamoto等[6]研究发现，gyrB基因已被广泛应用于细菌鉴定和分类的系统发育标记。gyrB蛋白的氨基酸序列比较保守，gyrB基因核苷酸序列的系统发育分析也反映了关系较近物种的进化关系[7-8]。在控制农作物害虫上，已经证明具有cry1和cry2基因的苏云金芽孢杆菌所产生的毒素对鳞翅目昆虫有高效杀虫活性。苏云金芽孢杆菌的杀虫效率是由cry基因编码的晶体蛋白决定[9-10]。已有研究表明，cry蛋白对多种昆虫的幼虫呈现毒性活性[11]。利用聚合酶链反应(PCR)和序列测定可鉴定特定的cry基因，预测苏云金芽孢杆菌的杀虫活性，发现新的cry基因[12]。除作为研究Bt资源的重要组成部分外，cry蛋白的类型及基因型分类有助于了解Bt的杀虫活性[13-14]。【本研究切入点】本研究课题组前期从广西的多个烟叶贮藏仓库中分离出一株具有较高烟草甲虫毒杀活性的苏云金芽孢杆菌(Bt)——GXZY032[15]，并对该菌株的生理生化指标和实际杀虫效果进行了研究，其在烟草仓库的烟草甲虫害管理上具有较高的应用价值，但针对其在蜡状芽孢杆菌群中的进化关系及cry基因验证的研究未见报道。【拟解决的关键问题】对苏云金芽孢杆菌GXZY032菌株进行16S rRNA和gyrB基因序列进化分析，了解该菌株在蜡状芽孢杆菌群中的分类关系，通过对cry基因的PCR鉴定，在基因水平上验证该菌株的杀虫功能，为进一步开发利用该菌株打下基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

苏云金芽孢杆菌(Bt) GXZY032菌株分离自广西烟草贮藏仓库的烟叶[15]。挑取单菌落，于LB培养基(胰蛋白胨 10 g，酵母粉 5 g，NaCl 10 g)28 ℃培养24 h。

1.2 DNA提取

取1.0 mL 菌液，8000 r/min离心1 min，去除上清培养基，得到苏云金芽孢杆菌菌体，按照博日科技细菌基因组DNA提取试剂盒(Biospin，#BSC12S1)说明提取DNA。电泳检测DNA质量，NanoDrop检测OD260/OD280后，ddH2O稀释20倍用作PCR模板。

1.3 16S rRNA序列PCR扩增并测序

16S rRNA序列扩增使用的引物为：27F：5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ 和1492R：5′-GTTACCTTGTTACGACTT-3′[16]。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行30个循环；72 ℃延伸5 min。预期的PCR产物片段长度为1.5 kb。通过1.0 %琼脂糖核酸电泳检测后，使用ABI Genetic Analyzer 3730xl(Applied biosystems)进行Sanger测序，测序引物分别为27F和1492R。获得的序列使用Vector NTI 11.0(Invitrogen)进行拼接，所得的Contigs用于核苷酸序列分析及进化树分析。

1.4 gyrB基因序列PCR扩增与测序

gyrB基因序列扩增使用的引物为UP-1：5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′和UP-2r：5′-AGCAGGGTACGGATGTGC GAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3′[17]。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 1 min、65 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，进行30个循环；72 ℃延伸5 min。预期的PCR产物片段长度为1.2 kb，通过1.0 %琼脂糖核酸电泳检测后，使用引物UP-1S：5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3′和UP-2Sr：5′-AGCAG GGTACGGATGTGCGAGCC-3′进行双向Sanger测序。

1.5 Cry基因检测

参考Shishir[18]的方法进行cry基因检测，引物序列见表1。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，退火温度详见表1，退火时间30 s，72 ℃ 30 s，进行30个循环；72 ℃延伸5 min。通过1.0 %琼脂糖核酸电泳检测分析每种cry基因的存在情况。

1.6 进化分析

用于进化分析的序列包括经测序所得的苏云金芽孢杆菌(Bt) GXZY032的16S rRNA序列及gyrB基因序列，其他用于建树的序列均来自美国国立生物技术信息中心(NCBI)的GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，每条基因序列均在结果中显示基因索引号(Accession number)。使用CLUSTALW进行序列比对，使用Mega ediors对序列进行编辑。使用MEGA 3.1以NJ(Neighbor Joining)和ME(Minimum Evolution)算法进行基于核苷酸序列的进化树分析。其中，选择自展值(Boostrap值)为1000进行可信度检验。

表1 用于PCR扩增和测序的引物序列

2 结果与分析

2.1 基于16S rRNA序列的进化树分析

对GXZY032菌株的16S rRNA序列进行PCR扩增测序，获得的基因片段大小为1465 bp，经测序和BLAST比对，所测序列与Bacillusthuringiensis(GenBank accession No. KT965084.1)序列的一致性最高，达100 %。为了分析该菌株与其他芽孢杆菌的进化关系，选取多个芽孢杆菌属(B.cereus、B.anthracis、B.mycoides、B.pseudomycoides和B.weihenstephanensis) 代表菌株的16S rRNA序列，使用ME算法构建系统进化树(图1)。从图1可看出，所分离GXZY032菌株的16S rRNA序列在进化树中与多个BtII群的菌株聚为一支，B.cereus的两个群B.cereusI和B.cereusII分别聚为一支，其中包含了不同Bt血清型菌株，但该分支的执行值较低，多个数值出现小于50 %的置信值。B.mycoides和B.weihenstephanensis聚在一个较远的分支，且该分支的置信值为99 %。

以引物up1和up2r对GXZY032菌株的gyrB基因序列进行扩增测序，获得1.2 kb的目标基因序列。从GenBank数据库中下载属于B.cereus不同群菌株的gyrB基因序列，通过比对和序列修剪，最终使用47个菌株的gyrB基因序列与GXZY032菌株的gyrB基因序列共同构建系统进化树(图2)。从进化树的结构可看出，BtI、BtII、B.cereusI和B.cereusII 4个群分别聚为一支，且进化树大分支之间的置信值均较高；GXZY032菌株以较高的置信值与BtII聚集在一个分支，与B.thuringiensisserroskildiensisIEBC-T45菌株距离最近。

2.2 Cry基因种类检测

为了明确GXZY032菌株所具有的杀虫相关cry基因类型，对表1中所列举的8种cry基因进行PCR扩增及琼脂糖电泳检测，获得的PCR产物大小分别为277、639和348 bp(图3)，说明GXZY032菌株包含的cry基因主要为cry1、cry2和cry10。

3 讨 论

16S rRNA序列的核苷酸序列常用于进行菌株分类和种属鉴定[5]。本研究以芽孢杆菌属不同菌株的16S rRNA序列构建进化树，对所分析的菌株进行归类，发现虽然B.cereus的2个群B.cereusI和B.cereusII分别聚在一个独立分支，但这2个分支的置信度不高，在多个分支上出现较小数值(小于50 %)，说明这些菌株在16S rRNA序列的核苷酸序列与其他分支之间差异不明显，可能是各分支置信度较低的原因。B.mycoides和B.weihenstephanensis聚在一个分支，这个分支的置信度较高，为99 %，且与其他菌株在遗传距离上较远。而BtI和BtII群的菌株被混合聚在一个大分支，且置信值较低，说明这2个群的菌株在16S rRNA序列上差异较小。其中，一个典型的Bt菌株Btser.berlinerATCC 10792正好处于这个大分支中。GXZY032菌株与多株苏云金芽孢杆菌聚在一起，说明从16S rRNA序列的水平上分析，可证实GXZY032菌株属于苏云金芽孢杆菌，与前期对该菌株表型分析鉴定及生理生化检测结果一致[15]。

Bootstrap值为1000，每个枝的前部分为该序列的GenBank基因号(Accession number)，后部分为该序列的来源菌株名称或编号 The boostrap confidence value was 1000，the front part of the branch was the accession number of the sequence，the rear part was the name of strain

本研究中，基于16S rRNA序列进行B.cereus的种属关系分析及群类分析具有一定的可行性，一些差异较明显的分支得到了分离，例如两个群B.cereusI和B.cereusII在进化树上分别出现在不同的分支。另一方面，16S rRNA序列在分析B.cereus的种属关系及群类上的分辨率不高，主要原因是在亲缘关系较近的物种之间16S rRNA序列通常只有单个碱基或者少数几个碱基的差异，造成进化树分支置信度较低。

Bootstrap值为1000，每个枝的前部分为该序列的GenBank基因号(Accession number)，后部分为该序列的来源菌株名称或编号The boostrap confidence value was 1000，the front part of the branch was the accession number of the sequence，the rear part was the name of strain

图3 cry基因种类鉴定结果

除16S rRNA序列外，gyrB基因序列也常用于细菌的遗传多样性分析[5-7]。gyrB基因是普遍存在于细菌内编码DNA促旋酶中B亚单位蛋白的基因，具有比16S rRNA序列更高的变异率，而根据大肠杆菌(Escherichiacoli)、假单胞菌(Pseudomonasputida)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)DNA促旋酶(gyrases)的氨基酸保守序列进行设计的简并引物up1和up2r，被广泛运用于扩增gyrB基因B亚基序列[17]。在进行B.cereus的研究中，gyrB基因序列也被用于种属关系分析及群类分析[19]。本研究结果表明，与16S rRNA序列的进化树相似，gyrB基因序列的进化树在BtI和B.cereusI两个群得到了聚集，但是具有更高的置信度，由此可看出，进行芽孢杆菌的群类分析时，gyrB基因序列比16SrRNA序列具有更高的分辨率；B.thuringiensisserkenyaeIEBC-T04B001、B.thuringiensisserthompsoniIEBC-T12和B.thuringiensisserhigoIEBC-T44 3个菌株均在16S rRNA和gyrB基因序列的2个进化树中聚集在BtI群的一簇中。此外，2个进化树都在B.cereusI这一簇中包含了B.thuringiensissertolworthiIEBC-T09菌株的序列；基于16S rRNA序列与gyrB基因序列的进化树在一定程度上具有一致性，与Punina[19]的报道一致。

本研究从gyrB基因序列的进化树中还发现GXZY032菌株分别聚集到两个大的分支，并具有较高的置信值。在其中一个分支中，包含了BtⅡ和BtⅢ。其中，GXZY032菌株与BtⅡ群聚到了一个大簇中，且这个簇中的每个分支都具有较高的置信值，更进一步证实GXZY032菌株属于苏云金芽孢杆菌的BtⅡ群，可为后期利用该菌株进行基因组分析或更进一步的应用研究提供坚实的分类基础。

不同的δ-内毒素类型对不同昆虫的毒杀作用存在差异[20]，因此进行cry基因类型的鉴定对于新发现苏云金芽孢杆菌的研究具有重要指导意义。已有研究表明，cry1基因在苏云金芽孢杆菌中出现的频率最高[22]，而cry基因的种类数量众多，本研究仅检测其中的8种类型。此外，不同来源的菌株可能会在基因序列上具有多态性，如果所扩增的片段大小与预期大小存在差异，原因可能是引物结合位点发生了变化，也有可能是包含有新的cry基因[20]。GXZY032菌株除了包含cry1，cry2和cry10基因外有可能还包含其他类型的cry基因，将来可通过基因组测序深入挖掘该菌株与内毒素相关的基因信息。

4 结 论

经基于16S rRNA和gyrB基因序列的多态性分析，明确了具有烟草甲幼虫毒杀作用的苏云金芽孢杆菌菌株GXZY032属于BtⅡ群；经PCR验证，GXZY032菌株具有cry1、cry2和cry103种类型cry杀虫基因。

致 谢：在本研究中，陈琦和邹承武完成数据分析和论文初稿的写作；孙建生、李季刚、邹克兴、苏赞、梁伟和蔡联合参与实验设计和实验结果分析，特致谢意。