菊芋果聚糖合成酶基因1-SST启动子克隆与活性研究

孙雪梅，宗 渊，杨世鹏，王丽慧，刘宝龙，张怀刚

(1.中国科学院西北高原生物研究所， 青海 西宁 810001；2.青海省作物分子育种重点实验室，青海 西宁 810001；3.中国科学院大学，北京 100049；4.青海省蔬菜遗传与生理重点实验室， 青海 西宁 810016；5.青海大学，青海 西宁 810016)

【研究意义】果聚糖是温带和冷寒地区植物非结构性碳水化合物的主要贮藏方式，约12 %～15 %的被子植物中发现含有果聚糖，是高等植物的第三大贮藏性碳水化合物，主要存在于菊科、禾本科、百合科等植物中[1]。除了作为贮藏碳水化合物外，果聚糖在提高植物的抗寒、抗旱乃至抗盐等方面发挥重要作用，如调节植物适应低温光合作用[2-3]、调控植物蔗糖分配[4]以及使植物适应水分亏缺[5-6]。作为一种功能性食品，低聚合度的果聚糖是一种低热量值的食品原料和食用甜味剂，是糖尿病和高血压患者的良好食品和甜味剂；较高聚合度的果聚糖是一种纤维型的益生素，对人体健康有促进作用[7-8]。菊芋是商品化果聚糖的重要来源之一[9]。【前人研究进展】植物果聚糖的结构因糖苷键的连接方式不同和聚合度(Degree of polymerization, DP)的大小差异而相对较为复杂(Vijn等，1999)。截止目前，在植物中发现主要有5种类型的果聚糖，分别为菊粉型果聚糖、梯牧草型果聚糖、混合型梯牧草型果聚糖、菊粉型果聚糖新生系列和梯牧草型果聚糖新生系列，菊粉型果聚糖主要存在于菊芋、菊苣等菊科植物中，这种果聚糖是由1-SST和1-FFT共同催化，在1-SST作用下催化2个蔗糖分子形成一个1-蔗果三糖分子，在1-FFT催化下延伸1-蔗果三糖形成菊粉型果聚糖。1-SST的表达与否决定了果聚糖的形成。多个植物中的1-SST和1-FFT基因已经被克隆和功能验证[10-13]，但关于这些基因的启动子序列分离克隆与功能分析尚未见报道。【本研究切入点】启动子作为基因表达调控的重要组成部分，控制基因表达(转录)的起始时间和表达程度，深入研究启动子的结构和功能，可利用基因工程技术对植物转基因表达进行调控。【拟解决的关键问题】本研究分离克隆了菊芋果聚糖合成关键基因1-SST的启动子，并开展功能分析，以期为菊芋1-SST基因在转录水平上的表达调控机制研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

试验材料为青芋1号菊芋，由青海省农林科学院提供。本氏烟草由青海省作物分子育种重点实验室提供。大肠杆菌(E.coli) 菌株TOP10 购自天根生化科技(北京) 有限公司。农杆菌GV3101 菌株购自上海生工生物工程技术公司。质粒提取试剂盒、高保真 DNA聚合酶购自Thermo公司，DNA Marker、SpeⅠ限制性内切酶、DNA 连接酶购于 NEB 公司，胶回收试剂盒，购于甘肃鹏程生物工程有限公司。

1.2 基因组DNA提取

采用CTAB-异丙醇方法，叶片液氮研磨后加CTAB提取液，65 ℃温育30 min，之后氯仿抽提后加异丙醇沉淀。沉淀的DNA水溶解后加RNAaseA去除RNA后再乙醇沉淀，沉淀的DNA水溶备用。

1.3 PCR和Tail-PCR

PCR扩增使用高保真酶high-fidelity Phusion DNA polymerase(Thermo-Fisher Scientific)在GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)PCR扩增仪进行。PCR程序为：98 ℃ 2 min；98 ℃ 15 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min。Tail-PCR根据已知的SST序列，在其5’端设计3个向外的巢式引物SP1、SP2和SP3。参照文献设计4个随机简并引物AD1-4。以20 ng的基因组DNA为模板，3个特异巢式引物与任一种随机引物进行Tail-PCR扩增(反应体系及反应条件按文献进行)。PCR和Tail-PCR反应产物在1.0 %琼脂糖凝胶上进行电泳分离检测，将目的带切胶并用琼脂糖凝胶回收试剂盒Tiangen TIANgel Midi Purification Kit(Tiangen)回收目的基因。将回收的PCR产物连接至pGEM-T Easy(Promega Corporation)载体上，转化大肠杆菌DH5α，阳性克隆送至华大公司测序。本研究中用到的所有引物在表1中。

1.4 农杆菌介导的瞬时表达

利用重组方法将克隆到的SST基因启动子全序列和起始密码子上游1/2和1/4区域替换pCAMBIA1301载体上启动GUS基因的35S启动子。PstI和NcoI 双酶切pCAMBIA1301载体，切除GUS基因前的35S启动子序列，回收载体骨架后与扩增的SSTP、1/2SSTP和1/4 SSTP片段进行重组反应(vazyme公司One step cloning kit)。反应产物转化大肠杆菌，PCR检测阳性菌落后，选取阳性菌落提取质粒，测序确认SSTP、1/2 SSTP和1/4 SSTP已正确融合于GUS基因5’端，获得pCAMBIA1301：SSTP1、pCAMBIA1301：SSTP2和pCAMBIA1301：SSTP3载体(图1)。以空载体pCAMBIA1301为对照，将测序正确的载体质粒采用液氮冻融法转化农杆菌GV3101菌株，PCR验证后选阳性菌落备用。

挑取PCR检验正确的菌落接入5 mL YEP(含抗生素kan 50 mg/L+rif 25 mg/L+gen 25 mg/L)液体培养基中，28 ℃摇床(180 r/min)过夜培养。培养物7000 r/min离心后收集菌体，用5 mL的重悬液(含10 mM MgCl2, 10 mM MES, 150 μM AS)重悬并室温静止3 h。静置后的农杆菌(设重悬液阴性对照)注射5叶期的本氏烟草(约生长1个月)叶片，每株注射2～3个叶片，每个处理注射3株，各设3个重复。注射后的植株培养在25 ℃黑暗过夜后，16 h光照，8 h黑暗条件下生长。农杆菌注射后3 d，采集注射叶(2个重复)，加GUS染液37 ℃过夜染色，再用70 %的乙醇脱色(去除叶绿素)后观察并拍照。

图1 载体构建

表1 引物序列表

1.5 生物信息学分析

使用Vector NTI 10软件(Invitrogen)进行序列拼接及比对。利用Primer Primer 5.0(Premier Biosoft)软件进行引物设计。利用神经网络启动子预测分析NNPP (http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html) 软件进行启动子核心区域生物信息学分析，在PLANTCARE网站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在线预测顺式作用元件。

图2 1-SST启动子Tail-PCR扩增电泳图

2 结果与分析

2.1 菊芋1-SST基因启动子的分离

用CTAB-异丙醇法提取菊芋基因组DNA，经1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测合格。以基因组DNA为模板，根据获得的核心基因组序列设计引物，通过Tail-PCR方法，分离到1816 bp的SST基因起始密码子上游约1816 bp的序列，命名为SSTP(图2)。

2.2 顺式作用元件预测

为明晰1-SST基因很有可能参与的生物学过程，通过PLANTCARE对FFTP序列进行了生物信息学分析。SSTP序列中共检测到140个顺式作用元件，除启动子所具备的基本元件44个TATA-box 和31个CAAT-box之外，尚有65个参与1-SST基因表达调控的顺式作用元件。在65个顺式作用元件中，23个顺式作用元件能够预测其功能。参与光调控的13个，脱落酸、厌氧过程、低温胁迫的调控元件各2个，水杨酸、抗逆反应、分生组织表达和胚乳表达的元件各1个(表2)。

2.3 瞬时表达研究启动子活性

为研究SST基因启动子的核心区域，分别用SSTP1(启动子全长)、SSTP2(1/2全长)和SSTP3(1/4全长)的序列替换pCAMBIA1301载体的CaMV 35S启动子获得载体pCAMBIA1301：SSTP1、pCAMBIA1301：SSTP1和pCAMBIA1301：SSTP3，并将pCAMBIA1301：SSTP1、pCAMBIA1301：SSTP2和pCAMBIA1301：SSTP3和pCAMBIA1301转化农杆菌GV3101后，在烟草叶片进行瞬时表达。GUS染色后发现，对照CaMV 35S、SSTP1、SSTP2和SSTP3均具有驱动GUS基因表达的启动子活性，且活性与CaMV35S相当(图3)。

表2 SSTP区域具有功能注释的顺式作用元件特征

3 讨 论

启动子是基因表达调控的顺式元件，启动子的克隆与功能分析可以为基因表达调控、构建基因工程载体，表达目的蛋白，探讨基因表达调控机制等提供理论依据。该研究通过Tail-PCR方法得到了1-SST基因起始密码子上游约1816 bp的启动子序列，通过瞬时表达的方法初步推断了启动子核心区域1-SST基因起始密码子400 bp以内。PLANTCARE分析表明，克隆到的启动子除含有多个TATA-box、CAAT-box 等基本启动子元件，还含有参与光调控、脱落酸、厌氧过程、低温胁迫及抗逆反应的调控元件。前期有研究表明，果聚糖积累可以使植物在多种环境胁迫下的抗逆性增强，如低温和干旱引起的缺水[14]、缺氧[15]、盐害[16]等。

图3 不同处理GUS染色后的烟草叶片

4 结 论

本研究进一步验证了果聚糖合成酶基因1-SST可能参与植物的抗逆生理过程。此外果聚糖的合成积累都在植物的根部，该组织与其他组织相比，弱光是其主要特征，因此在SST区域中存在较多的光反应与调控元件。