白花蛇舌草紫外指纹图谱共有峰率和变异峰率双指标序列分析法

杨新周，董 毅，党菱婧，田孟华，田先娇，马艳粉

(1.德宏师范高等专科学校民族医药研究所，云南 芒市 678400；2.德宏师范高等专科学校理工学院，云南 芒市 678400；3. 德宏职业学院，云南 芒市 678400；4.昭通市天麻研究院，云南 昭通 657000)

【研究意义】白花蛇舌草(HedyotisdiffusaWilld.) 属茜草科(Rubiaceae)耳草属植物[1-2]，傣语称“芽零哦”。随着环境不断恶化，白花蛇舌草的生长环境遭到破坏，市场上出现伪劣假冒的白花蛇舌草药材，故加强滇产白花蛇舌草的质量控制与鉴别十分重要。【前人研究进展】目前白花蛇舌草的研究主要集中于化学成分[3-5]、药理药效及活性等方面[6-8]。对云南不同产区白花蛇舌草的鉴别研究未见报道。【本研究的切入点】依据紫外光谱的指纹特性，利用紫外光谱法对云南省不同产区的白花蛇舌草进行鉴别。【拟解决的关键问题】应用多维共有峰率和变异峰率双指标系列法建立白花蛇舌草的紫外指纹图谱，为不同产区白花蛇舌草的鉴别和质量控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

样品(S1～S23)采自云南23个不同产区，经德宏师专施洪教授鉴定为茜草科(Rubiaceae)耳草属植物白花蛇舌草干燥全草，样品信息见表1。乙酸乙酯、甲醇(国药集团化学试剂有限公司，AR)。

1.2 仪器

电子天平(AL204，METTLER TOLEDO)，高速万能粉碎机(FW-100，天津市华鑫仪器厂)；双光束紫外可见分光光度计(TU-1901，北京普析通用仪器有限公司)，超声波清洗机(WF-500E，宁波海曙五方超声设备有限公司)。

1.3 样品前处理及测定方法

1.3.1 样品的制备 白花蛇舌草洗净晾干，粉碎，过0.3 mm筛，制得样品。

1.3.2 测试液的制备及试验条件 精确称取样品0.5000 g(平行3份)于50 mL具塞三角瓶中，依次用25 mL乙酸乙酯、甲醇、水在超声条件下提取一定的时间，过滤，稀释定容到25 mL容量瓶中，即得到乙酸乙酯、甲醇、水溶液的样品溶液。将样品溶液在190～400 nm扫描波长范围内，2.0 nm狭缝宽度，0.5 nm的采样间隔条件下进行测定。测定中分别以乙酸乙酯、甲醇、水作为参比溶液。

2 结果与分析

2.1 光谱信号预处理

为了消除测试过程中的基线漂移、背景噪音、克服光谱带重叠问题，采用TU-1901双光束紫外可见分光光度计紫外软件对白花蛇舌草紫外光谱数据进行一定的处理(3组平均，9点平滑，二次微分)，通过光谱预处理，可以提高光谱的分辨率、强化谱带特征[6]。

2.2 最佳提取时间优化

为了研究出最佳提取时间，依次采用乙酸乙酯、甲醇、水对样品S11进行超声提取20、30、40、50 min，提取液过滤定容到25 mL，其中甲醇、水提取液稀释10倍后测定，制备的试液按照1.3.2的测定条件进行测试，以提取峰为条件确定不同提取溶剂的最佳提取时间，经过实验得出，乙酸乙酯、乙醇、水最佳提取时间分别为30、40、30 min，在此条件下，乙酸乙酯、甲醇、水3种溶剂的提取峰数最多，效果最佳。

2.3 指纹图谱稳定性实验

将样品S11的乙酸乙酯、甲醇、水等3种溶剂的提取液存放于0～4 ℃的冰箱中，分别于0、5、24、48、60 h按照1.3.2测定3次，以提取峰的波长进行计算，结果乙酸乙酯、甲醇、水等3种溶剂制备的提取液在48 h内稳定。

2.4 指纹图谱重现性实验

分别称取样品S11 5份(0.5 g/份)，按照1.3.2进行样品液制备、测定，以乙酸乙酯、甲醇、水提取物的波长计算RSD，3种提取物的RSD分别为0～0.47 %，0.26 %～0.64 %，0～0.50 %，说明在此提取条件下，白花蛇舌草的乙酸乙酯、甲醇、水提取液的重现性较好。

图1 白花蛇舌草乙酸乙酯提取物紫外指纹图谱

图2 白花蛇舌草甲醇提取物紫外指纹图谱

2.5 不同产区白花蛇舌草紫外指纹图谱

图1～3为不同产区白花蛇舌草紫外指纹图谱。

2.6 白花蛇舌草紫外指纹图谱共有峰率及变异峰率的确定

通过对白花蛇舌草的乙酸乙酯、甲醇、水提取物进行光谱测定后，依据吸收峰最大差异是否小于相邻组之间的平均波数差将不同溶液测定吸收峰分组，通过判定，若小于则为共有峰，若大于则为变异峰[9-10]。通过式(1)、(2)、(3)计算出不同产地白花蛇舌草之间的共有峰率和变异峰率：

P(%)=(Ng/Nd) ×100

(1)

Pva(%)=(na/Ng) ×100

(2)

Pvb(%)=(nb/Ng) ×100

(3)

式中,P为共有峰率；Pva,Pvb分别为a、b图谱的变异峰率；Ng为2个图谱中共有峰数；Nd为独立峰数；na，nb分别为a、b图谱的变异峰数，其中，Nd=Ng+na+nb[11-15]。

2.7 不同产区白花蛇舌草共有峰的识别

不同产区白花蛇舌草依次经过乙酸乙酯、甲醇、水超声提取后，经紫外光谱检测，得到紫外指纹图谱吸收波数和共有峰的识别数据，其中乙酸乙酯提取物共有峰主要在249、259、264、272、288、293、318、328、352、386 nm附近，甲醇提取物共有峰主要在191、202、207、210、213、217、222、273 nm附近，水提取物共有峰主要在191、201、204、207、249 nm附近。

2.8 基本关系组、对及分析

测试不同产区白花蛇舌草的乙酸乙酯、甲醇、水溶剂的制备液，对3种溶液的原始紫外光谱图进行平均、平滑、微分处理，利用式(1)、(2)、(3)计算出不同产地白花蛇舌草之间的共有峰率和变异峰率，按照共有峰率从大到小的顺序排列，建立不同产区白花蛇舌草的共有峰率和变异峰率双指标序列。通过共有峰率和变异峰率双指标序列可以描述不同产地之间白花蛇舌草的亲缘远近关系，共有峰率越大说明两个样品的紫外图谱之间相似程度越高，变异峰率越大，说明两个样品之间差异性越大。通过共有峰率的平均值可以反应云南不同产区白花蛇舌草的相似性整体水平，共有峰率大于平均值的说明两个样品之间变异率小，相似性高。

图3 白花蛇舌草水提取物紫外指纹图谱

通过计算，云南23个不同产区的白花蛇舌草组成的共有峰率和变异峰率系列中，共有峰率和变异峰率都存在差异，说明23个不同产区白花蛇舌草之间存在差异。由于23个产区的气温、降雨量、海拔、生长的地理环境不同，导致不同产区的白花蛇舌草之间相同的化学成分含量不同或是化学成分种类不同，致使不同产区之间白花蛇舌草存在差异。通过建立不同产区白花蛇舌草紫外指纹图谱的共有峰率和变异峰率双指标序列，可以找到不同产区之间的相似样品。从表2中得出，云南不同产区白花蛇舌草的总体相似度在22.2 %～92.3 %，其中样品S3和S14，S4和S5、S5和S23、S6和S18、S7和S16、S8和S21、S13和S15共有峰率均在75 %以上，说明以上2个样品之间相似程度较高。

表2 相似白花蛇舌草药材的共有峰率和变异峰率

续表1 Continued table 1

序列SerialP; Pva; Pvb序列SerialP; Pva; Pvb序列SerialP; Pva; Pvb序列SerialP; Pva; PvbS13∶S8(73.3;9.1;27.3)S14∶S22(76.9;10;20)S11∶S23(54.5;41.7;41.7)S16∶S20(70.6;25;16.7)S13∶S19(73.3;9.1;27.3)S14∶S5(73.3;0;36.4)S11∶S6(52.6;70;20)S16∶S13(68.8;36.4;9.1)S13∶S20(73.3;9.1;27.3)S14∶S21(71.4;10;30)S11∶S13(52.6;70;20)S16∶S23(68.4;15.4;30.8)S13∶S22(71.4;20;20)S14∶S8(66.7;10;40)S11∶S16(52.4;54.5;36.4)S16∶S5(66.7;25;25)S13∶S16(68.8;9.1;36.4)S14∶S4(64.7;0;54.5)S15∶S13(84.6;9.1;9.1)S16∶S21(64.7;36.4;18.2)S13∶S12(62.5;20;40)S14∶S6(64.3;22.2;33.3)S15∶S19(73.3;9.1;27.3)S16∶S17(61.1;27.3;36.4)S17∶S4(73.7;14.3;21.4)S14∶S15(64.3;22.2;33.3)S15∶S6(71.4;20;20)S16∶S3(58.8;50;20)S17∶S23(73.7;14.3;21.4)S14∶S18(60;22.2;44.4)S15∶S21(66.7;20;30)S16∶S15(58.8;50;20)S17∶S5(72.2;23.1;15.4)S14∶S23(58.8;10;60)S15∶S18(66.7;20;30)S20∶S21(80;16.7;8.3)S17∶S7(66.7;33.3;16.7)S18∶S6(92.3;7.7;0)S15∶S14(64.3;33.3;22.2)S20∶S10(73.3;27.3;9.1)S17∶S12(66.7;33.3;16.7)S18∶S15(66.7;30;20)S15∶S7(62.5;20;40)S20∶S13(73.3;27.3;9.1)S17∶S21(61.1;45.5;18.2)S18∶S14(60;44.4;22.2)S15∶S8(62.5;20;40)S20∶S23(72.2;7.7;30.8)S17∶S16(61.1;36.4;27.3)S18∶S19(58.8;30;40)S15∶S20(62.5;20;40)S20∶S5(70.6;16.7;25)S17∶S2(58.8;50;20)S18∶S13(56.3;44.4;33.3)S15∶S11(61.1;9.1;54.5)S20∶S16(70.6;16.7;25)S17∶S10(58.8;60;10)S18∶S22(56.3;44.4;33.3)S15∶S22(60;33.3;33.3)S20∶S7(64.7;27.3;27.3)S17∶S8(57.9;45.4;27.3)S18∶S10(55.6;85.7;71.4)S15∶S16(58.8;20;50)S20∶S8(64.7;27.3;27.3)S17∶S20(57.9;45.5;27.3)S18∶S21(52.9;44.4;44.4)S15∶S23(58.8;20;70)S20∶S19(64.7;27.3;27.3)S21∶S8(80;8.3;16.7)S18∶S5(52.6;40;50)S19∶S8(75;16.7;16.7)S20∶S4(63.2;16.7;41.6)S21∶S20(80;8.3;16.7)S22∶S14(76.9;20;10)S19∶S13(73.3;27.3;9.1)S20∶S11(63.2;16.7;41.7)S21∶S13(78.6;18.2;9.1)S22∶S13(71.4;20;20)S19∶S15(73.3;27.3;9.1)S20∶S15(62.5;40;20)S21∶S10(78.6;18.2;9.1)S22∶S19(62.5;20;40)S19∶S21(68.8;27.3;18.2)S20∶S22(62.5;40;20)S21∶S23(76.5;0;30.8)S22∶S20(62.5;20:40)S19∶S9(66.7;40;10)S23∶S5(82.3;14.3;7.1)S21∶S5(75;8.3;25)S22∶S15(60;33.3;33.3)S19∶S7(64.7;27.3;27.3)S23∶S21(76.5;30.8;0)S21∶S14(71.4;30;10)S22∶S3(60;33.3;33.3)S19∶S12(64.7;27.3;27.3)S23∶S7(76.5;23.8;7.7)S21∶S19(68.8;18.2;27.3)S22∶S5(58.8;20;50)S19∶S20(64.7;27.3;27.3)S23∶S8(76.5;23.1;7.7)S21∶S15(66.7;30;20)S22:S7(56.3; 33.3;66.7)S19∶S11(63.2;16.7;41.7)S23∶S17(73.7;21.4;14.3)S21:S4(66.7; 8.3;41.7)S22:S18(56.3; 33.3;44.4)S19:S23(63.2;16.7;41.7)S23:S4(73.7; 14.3;21.4)S21:S16(64.7; 18.2;36.4)S22:S21(56.3; 33.3;44.4)S19:S22(62.5;40;20)S23:S20(72.2; 30.8;7.7)S19:S10(62.5;40;20)S23:S10(70.6;29.4;0)S23:S16(68.4; 30.8;15.4)S23:S19(63.2; 41.7;16.7)

3 讨 论

利用乙酸乙酯、甲醇、水为溶剂，依据极性顺序：乙酸乙酯<甲醇<水，依次对白花蛇舌草进行超声提取，利用紫外光谱法测定不同提取溶液中的紫外吸收光谱，采取平均、平滑、积分的手段建立紫外指纹图谱和双指标序列。通过实验发现，不同溶液的提取物紫外光谱存在差异，是由于不同极性溶剂可以提取出白花蛇舌草中不同极性的化学成分。通过建立白花蛇舌草紫外指纹图谱双指标系列，可以探究出不同产区之间的相似样品。云南不同产区白花蛇舌草的总体相似度在22.2 %～92.3 %，其中样品S3和S14、S4和S5、S6和S18、S7和S16、S13和S15等不同产区的共有峰率均在75 %以上，说明以上2个样品之间相似程度较高。通过比较发现S3和S14的生长地均为亚热带季风气候，年平均降雨量1530～1565.8 mm，全年无霜期较多。S4和S5样品均生长在德宏州境内，属于亚热带季风气候，年平均降雨量1400～1800 mm。S6和S18生长地年平均气温为17.8 ℃左右，S7和S16样品生长地海拔分别为1437、1515 m，年平均气温分别为18、16 ℃，S7和S16样品生长地海拔和气温差距较小。S13和S15生长地均在普洱市境内，属于热带季风气候。不同产地之间的白花蛇舌草具有很高的相似度是因为生长的地方气温、气候类型、年降雨量、日照时间、无霜日、生长的土壤等具有类似的特点。云南不同产区白花蛇舌草之间的相近情况能够被紫外指纹图谱中共有峰率和变异峰率体现出来，为白花蛇舌草的研究奠定一定的基础。

4 结 论

采用紫外分光光度法测定云南23个不同产区白花蛇舌草190～400 nm 紫外图谱，通过实验发现最佳称样量为0.5 g，乙酸乙酯、甲醇和水3种溶剂最佳提取时间分别为30、40、30 min，3种溶剂提取液在48 h内稳定。白花蛇舌草紫外指纹图谱显示，白花蛇舌草不同产区样品间最大共有峰率为92.3 %，最小共有峰率为22.2 %。采用紫外光谱法测试手段并结合双指标(共有峰率和变异峰率)序列分析法，构建的云南不同产区白花蛇舌草的紫外指纹图谱，可阐明不同产区间白花蛇舌草的相似程度和差异，为白花蛇舌草的鉴定及其品质鉴定评价奠定基础。