人X染色质制备方法改进

王 剑，张锦萍，张中林

（辽宁医药职业学院，辽宁 沈阳 110101）

正常女性体细胞核中的一对X染色体在分裂间期只有一个有活性，呈常染色质状态，另一个无活性，螺旋化呈异固缩状态，紧贴核膜内缘，形成直径约为1μm的椭圆形浓染小体，称为X染色质，亦称Barr小体（Barr body）[1]。该失活的X染色体可以来自父方，也可以来自母方，失活发生于胚胎发育第16天，一旦失活，那么由此细胞增殖产生的所有子代细胞也总是这一条X染色体失活[1]。间期核内X染色质数目等于X染色体数目减1，正常女性每个体细胞中应见到1个X染色质，正常男性体细胞中见不到X染色质。失活X染色体上的基因不是全部失活，一部分仍有转录活性，故个体X染色体数目异常者表型有别于正常个体[1]。因此，人X染色质的制备与观察在临床广泛用于医学需要的胎儿性别鉴定和性染色体数目异常疾病的诊断，是高职医学遗传学课程中的一个重要的教学实验[2]。经过数轮教学实验，我们对人X染色质的传统制备方法加以改进，制片效果更好，且可缩短实验时间，节约硫堇染液。

一、材料和方法

（一）器材

器材包括光学显微镜、擦镜纸、水浴箱、载玻片、盖玻片、清洁纱布、牙签、滴管、吸水纸、红蓝铅笔、染色缸、片架等。

（二）试剂

试剂包括香柏油、清洁剂（乙醚7份+无水乙醇3份）、70%乙醇、95%乙醇、蒸馏水、5 mol/L HCl溶液、硫堇染液等。

（三）方法

方法为乙醇固定法。受检女性用清水漱口，以牙签钝端刮取口腔颊部粘膜表面上皮细胞（同一方向刮取几行），弃去第一次刮取物，用第二次刮取物。用红蓝铅笔在载玻片左侧写上编号或学号或姓名，中央画出涂片范围（直径1 cm圆圈），将刮取的上皮细胞涂片（牙签钝端侧面贴紧玻片滚动前行，涂完一行，同法涂下一行，不要来回涂抹，涂片范围在所画圆圈之内）。标本片稍晾干，置95%乙醇中固定20～30分钟。取出标本片晾干，蒸馏水中漂洗3次（每次漂洗之后换水）。浸入30℃的5 mol/L HCl溶液中水解20～30分钟，取出后蒸馏水中漂洗3次（即每次漂洗之后换水）。硫堇染液染色30分钟（滴加1滴硫堇染液于所画圆圈中央，轻轻晃动标本片使硫堇染液散布于所画圆圈之内），然后在蒸馏水中漂洗3次（即每次漂洗之后换水）。70%乙醇中分色处理5分钟，蒸馏水漂洗。加盖片镜检，先在低倍镜下选择典型的细胞核，再转换高倍镜、油镜，仔细寻找、观察X染色质。

二、结果

低倍镜下可见女性口腔黏膜上皮细胞核为圆形或椭圆形，染成紫蓝色，选择典型的细胞核应该是核较大，染色清晰，轮廓清楚无缺损。油镜下观察X染色质的特征是，紧贴核膜内侧缘，染色深，轮廓清晰，呈圆形、扁平形、三角形或馒头形，大小约 1.5μm （见图 1）。

三、讨论

人X染色质是女性在胚胎发育第16天，两条X染色体中随机一条发生异染色质化而失活，一旦失活，那么由此细胞增殖产生的所有子代细胞也总是这一条X染色体失活。失活X染色体上的基因不是全部失活，一部分仍有转录活性，故个体X染色体数目异常者表型有别于正常个体。间期核内X染色质数目等于X染色体数目减1，正常女性每个体细胞中应见到1个X染色质，正常男性体细胞中见不到X染色质。

图1 人X染色质（油镜下）

XO女性：体细胞核中观察不到X染色质，临床表现为身材矮小，身高一般低于150厘米；生殖器与第二性征不发育，女性外阴发育幼稚、有阴道、子宫小或缺如，乳头间距大、乳房及乳头均不发育；躯体发育异常，多痣、眼睑下垂、耳大位低、腭弓高、后发际低、颈短而宽、胸廓桶状或盾形等，智力发育程度不一，寿命与正常人同。XXX女性体细胞核中可见到两个X染色质，一般发育正常，但智力低下，外生殖器无异常，性腺发育不良，大多卵巢内有正常卵泡，部分患者有小子宫。

XXY男性体细胞核中可观察到一个X染色质，患者表现为睾丸小而硬、曲细精管纤维化、透明样变，管腔闭塞，无精子发生，男性第二性征发育差，有女性化表现，如无胡须、体毛少、阴毛分布如女性、阴茎龟头小等，约25%的患者有乳房发育、身材高、四肢长、部分智力低下，有的精神异常有精神分裂症倾向。

随着对X染色质深入研究，如剂量补偿作用[3]、XIST RNA与X染色质共域[4]等，X染色质异常与疾病的关系将逐渐被揭示。人X染色质的制备与观察可用于鉴定医学需要的胎儿性别和诊断性染色体数目异常的疾病，广泛应用于临床，也是医学遗传学一个重要的教学实验。

我们按照传统制备方法经过几轮教学实验，发现效果不太理想，而且4学时的实验课时间也不太充足，于是我们查阅文献资料发现，目前X染色质制备方法有涂片法和滴片法[5]两大类。染色方法有Giemsa染色、甲苯胺蓝染色[6]、石炭酸复红染液染色[7]、硫堇染色[8-10]等。我们选择对人X染色质的传统制备方法[11]（涂片法-硫堇染色）进行改进，利用课余时间多次摸索，改进之后，制片效果更好，且可缩短实验时间，节约硫堇染液。

一是涂片方法的改进：传统方法将刮取的上皮细胞涂在洁净的载玻片上，平推成薄层细胞平铺片。而平推不易使得细胞单层均匀铺开，易造成有的地方细胞比较分散，有的地方细胞重叠，故观察效果不理想。我们对涂片方法加以改进，以牙签钝端侧面贴紧玻片滚动前行，使细胞单层均匀铺开在红蓝铅笔预先画好的直径1 cm圆圈范围之内，涂完一行，同法再涂下一行，不要来回涂抹。

二是染片方法的改进：传统方法将标本片不重叠摆放于平皿内，加硫堇染液没过标本片染色，这样需要的硫堇染液比较多，造成浪费（如果将标本片插入片架置于染缸内染色，所需硫堇染液更多很多）。我们将硫堇染液装入小塑料滴瓶中，每张标本片滴加1滴硫堇染液于所画圆圈中央，轻轻晃动标本片使硫堇染液散布于所画圆圈之内，如此染片所需硫堇染液大大减少，节约很多，而且整张标本片很干净，也便于之后蒸馏水漂洗。

三是分色时间的改变：传统方法硫堇染液染色30分钟后，蒸馏水洗3次，50%乙醇中漂洗1次，70%乙醇中分色处理15～30分钟，蒸馏水漂洗，然后初步镜检：若染色过深，继续分色；若染色过浅，则放硫堇染液中再染。经过几轮教学实验，我们发现分色太过，观察效果不太理想，如果继续染色，4学时的实验课时间又不太充足，于是我们利用课余时间多次摸索，确定70%乙醇中分色处理5分钟即可，然后蒸馏水漂洗，加盖片镜检。学生实验课如此制备X染色质，绝大多数观察都比较理想，先在低倍镜下选择较大、染色清晰、轮廓清楚无缺损的典型细胞核，再转换高倍镜、油镜，可以观察到紧贴核膜内侧缘、染色深、轮廓清晰、呈圆形、三角形或馒头形的X染色质，提高了实验教学效果，为人X染色质的制备实验临床和教学提供参考。