加权基因共表达网络分析探索种植体周围炎中的功能基因模块

周海伦 , 蒋延波 , 唐礼

（广西医科大学附属口腔医院；广西口腔颌面修复与重建研究重点实验室；广西颌面外科疾病诊治研究重点实验室；广西颅颌面畸形临床医学研究中心，广西 南宁）

0 引言

口腔种植修复因其具有固位良好、邻牙损伤小等优点成为牙列缺失、缺损修复的主要手段。然而，种植体周围炎是造成种植修复失败最常见的原因。种植体周围炎指发生在种植体周围软、硬组织以菌斑生物膜为始动因素的感染性疾病，被认为是细菌挑战与宿主反应不平衡的结果。种植体周围炎是目前研究热点，但其病因和发病机制尚未明确。 近期wu等一项基于芯片技术犬种植体周围炎软组织基因表达谱，揭示部分犬种植体周围炎差异基因在种植体周围炎的表达和作用。转录组测序（RNA sequencing,RNA-Seq）是近年来开发的一种利用高通量深度测序技术进行的转录组分析方法。RNA-seq它已广泛应用于癌症研究、发育生物学和系统生物学。然而，在口腔疾病中的研究仍较少。据我们所知，较基因芯片技术，本次实验首次应用第二代测序技术用于人种PI全转录组的研究。WGCNA的目的是找到用于共表达的基因模块，并探索基因网络与目标表型之间的关系以及网络中的中枢基因。在本研究中，我们收集了PI患者和HI个体的牙龈组织，使用第二代高通量RNA测序数据，构建了基因共表达网络分析。接下来，我们选择关键模块以通过Hallmarks基因集富集分析和PI中相关途径成员的表达分析来揭示关键的生物学过程或信号传导途径。在这项研究中，我们希望可以使用高通量测序技术来分析困扰PI研究的核心问题。

1 材料与方法

1.1 样本采集

采集2017年12月至2018年12月就诊于广西医科大学附属口腔医院PI及HI人的牙龈组织标本。PI诊断标准[1]如下：（1）轻探有出血或化脓。（2）探诊深度≥6 mm。（3）咬合负重功能一年后，由于初始骨重塑或进行性骨吸收导致的骨吸收水平变化≥2 mm。根据既定方案，在治疗PI外科手术清创过程中移除种植体周围发炎的软组织。健康牙龈：无临床感染患者的牙龈组织作为对照组。这些患者均采用智齿切除术或正畸需要切除的牙齿进行手术。

18岁及以上未吸烟和饮酒的患者均排除在全身性疾病和其他口腔疾病之外，如常见粘膜疾病、肿瘤等。本研究经广西医科大学伦理委员会（2017-165号）批准。所有患者同意参与研究，并在手术前签署知情同意书。

1.2 RNA 测序

在Hiseq 2500仪器上进行全转录组RNA深度测序，由Illumina（圣地亚哥，加利福尼亚州，美国）提供的说明书指示建立文库。

1.3 RNA 序列数据的差异表达基因分析

RNA测序数据使用Galaxy工具进行分析。利用EdgeR软件包进行差异基因分析。其中，P＜0.05和log2fc（FC）≥2的mRNAs被认为是差异表达基因（DEGs），并利用R软件包完成了upset维恩图、火山图和差异基因热图。

1.4 建立加权基因共表达网络分析，重要模块的功能富集分析

利用R语言进行加权基因共表达网络分析。包括三个步骤：计算基因之间的相关系数，构建共表达网络以及确定具有特征和功能的基因模块。此外，我们还计算了模块中每个基因的度（degree）与其 - log10（P值）之间的关系。筛选出明显富集的基因模块。以Hallmarks基因集为来源，利用基因富集分析揭示关键基因模块的关键生物学过程或信号通路。取P＜0.01、最小计数为3、富集系数>1.5的项目，并根据它们的成员相似性将其分组。使用Metascape工具进行功能富集分析及可视化。

2 结果

2.1 RNA 定量与差异表达基因分析

本研究检测5例种HI牙龈样本中RNAs的表达水平，并以5例HI作为对照。EdgeR将所有基因count数归一化为M-值的加权截尾均值（TMM）。结果显示，与HI组相比，PI组有172个显著上调的mRNAs和5064个显著下调的mRNAs。

图1A为差异基因表达火山图，从 -log10 P value and log2 (fold change, FC) 两个维度上所有显著不同表达的mRNAs的分布。前10个差异基因列表如表1所示。

图1 A 差异基因火山图（注：红色点表示相对于对照样本表达量上调基因，绿色点为下调基因，黑色点为无显著差异基因。）

表 1 PI-vs-HI 前10 个差异基因列表

2.2 加权基因共表达网络分析

如图2所示，可见基因被分配到11个模块用于功能和模块相关性分析。根据每个模块的特征基因，计算这些模块与每个性状之间的相关性。

2.3 关键基因模块的信号通路分析与基因表达分析

kME被用来评估Hub基因之间有效连接性和识别模块成员。选择kME>0.7作为模块的成员，也被称为Hub基因，能更好地代表整个模块的表达趋势。根据模块与性状和功能的相关分析结果。每个基因的度k和-log10（p）之间的相关性被加权，加权结果显示这三个模块紫色、绿色、红色（kMEpurple、kMEgreen、kMEred）中的基因与HI的发病机制显著相关（P＜0.05，图3A）。

通过Hallmarks基因集基因富集分析揭示关键基因模块的关键生物学过程或信号传导途径。如图3B所示，在紫色模块中，Hub基因主要富集在IL2-STAT5信号通路、NF-κB/TNFα 信号通路和血管生成信号通路上。在kME绿色模块中，Hub基因主要富集在Hedgehog信号通路、Wnt β-Catenin信号通路和IL2-STAT5信号通路上。在红色模块中，Hub基因主要富集在过氧化物酶生成、IL2 STAT5信号通路和上皮间充质转化过程中。

图3 A）紫、绿、红模块的基因显著性，横轴代表模块，纵轴代表模块的显著性。B）对应三个模块基因成员的富集分析情况

3 讨论

本研究采用第二代高通量测序技术对种植体周围炎软组织病变进行全转录组分析。为了分析基因表达谱的动态变化，建立了WGCNA，以探索基因网络与表型之间的关系。WGCNA可以避免现有生物学方法的广泛假阳性和假阴性结果，并排除差异基因分析中不合理的统计过滤。在这项研究中，我们首先使用WGCNA揭示PI机制，发现三个重要功能模块，随后对其Hub基因进行功能富集分析，发现IL2-STAT5、Wntβ-Catenin信号通路、NF-κB/TNFα 信号通路、Hedgehog信号通路、过氧化物酶生成与PI发病机制密切相关。

三个关键模块的富集结果均包含IL2 STAT5信号传导途径，表明IL2介导的免疫细胞活化在种植体周围炎中起关键作用。目前IL-2与种植体周围炎的研究较少。研究发现IL-2受体依赖性核转录因子STAT5在激活Treg细胞中起关键作用，而Treg细胞则在体内负调节人体的免疫反应。作为宿主压力的重要途径，由IL2-STAT5信号传导途径介导的Treg细胞的活化在PI牙龈组织中被活化。在某种程度上，这阻止了炎症信号的级联扩增，并减轻了由炎症和感染引起的局部组织坏死。然而，这种反应也是诱导宿主免疫耐受，引起持续感染和反复临床症状的重要途径。这为我们提供了一些临床意义：IL 2-STAT5途径阻滞剂，例如CMD17819或Pimozide20，可能有助于PI治疗并在分子水平上抑制Treg细胞活化。

Wntβ-Catenin信号通路是近年来的研究热点。在牙周炎中，Wnt信号通路已经在包括疾病的发生、发展等多个方面被阐明具有重要的作用。已有一些研究表明，Wnt通路可能参与牙龈卟啉单胞菌介导的牙周炎免疫反应。而在种植体骨结合形成的机理研究中，目前研究最多的信号为：Wnt信号通路，其次为BMP信号通路、MAPK信号通路、NF-KB/TFNa。其在包括成骨细胞等细胞增殖、成熟过程中起着决定性的作用。本研究中富集结果相似，提示其与PI的发病机制密不可分。Hedgehog信号通路在肿瘤、发育等领域研究较多。在牙种植体周的研究中，主要与骨再生工程有关，作为众多成骨因子之中的一员，Sonic hedgehog能够通过骨形成蛋白及甲状旁腺激素蛋白等信号通路诱导间充质干细胞向成骨细胞分化，并在骨再生修复过程中发挥着重要的作用。结合本研究结果，提示Hedgehog信号通路在PI可能通过影响成骨破骨平衡中起到一定的作用。

另外本研究结果还发现，关键模块（KMEred）还富集到过氧化物酶生成的生物学过程。过氧化物酶生成与氧化应激有关。有研究表明，种植体周围炎患者的龈沟液中氧化应激标志物升高、唾液中无明显变化。Chen等人发现，松动种植体周围组织中NOX-1和NOX-2的表达高于对照组。提示种植体周在感染和其他外源性刺激介导的活性氧反应在种植体周围炎发生发展中的作用。

综上，本研究通过二代高通量技术对人种植体周围炎软组织测序，通过WGCNA生物信息学分析得到三个关键模块、对应hub基因富集到的七种信号通路/生物学过程（IL2-STAT5信号通路、NF-κB/TNF、血管生成信号通路、Hedgehog信号通路、Wnt β-Catenin信号通路、过氧化物酶生成、上皮间充质转化过程）与种植体周围炎的发生发展密不可分，提示其可能作为种植体周围炎的关键机制，应成为今后研究的重点，为进一步全面揭示种植体周围炎机制和治疗提供新的思路。