减蛋综合征病毒（EDS76）的分离和鉴定

王丹丹

（哈药集团生物疫苗有限公司，哈尔滨 150227）

减蛋综合征76（EDS76）是由减蛋综合征病毒（EDS76V）引起的鸡的重要病毒病之一，可引起产蛋鸡的产蛋量降低和产蛋品质下降。该病已在世界范围内的许多国家流行，成为引起产蛋损失的主要疫病之一[1-2]。EDS76V可使鸡产蛋率下降10%～30%，甚至高达41%，蛋的破损率达38%～40%，无壳蛋、软壳蛋达15%，给养禽业造成严重的经济损失，1976年Yan首次分离到鸡减蛋综合征病毒（EDS76V）[3-4]。我国于20世纪80年代末在肉用种鸡群中发现减蛋综合征以来，相继分离到许多株EDS76V病毒[5-7]。2005年黑龙江省绥化市1个体养鸡场的190日龄商品蛋鸡突然出现产蛋下降，产蛋率由95.4%下降到72.5%，蛋壳颜色变浅，并出现大量的弱壳蛋、无壳蛋、沙壳蛋和畸形蛋；除了表现产蛋下降，并无其他明显的临床症状，初步怀疑为减蛋综合征。采集发病鸡的输卵管，用鸭胚进行病毒分离，分离到一株具有血凝性病毒，经一系列鉴定，确定为EDS76V，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料

鸭胚：9～10日龄鸭胚，从无减蛋综合征感染的鸭场购买鸭蛋，自行孵化。病毒阳性血清：新城疫病毒（NDV）和减蛋综合征病毒（EDS76V）阳性血清购自中国兽药监察所，由实验室保存。

1.2 病毒分离

1.2.1 病料采集和处理

取产软壳蛋和无壳蛋、初步怀疑感染减蛋综合征病毒的鸡，剖杀，取输卵管的狭部，用研钵研磨，加入PBS液制成悬液，反复冻融3次，3 000 r·min-1离心10 min，吸取上清，按每毫升液体加入青霉素2 000 U、链霉素2 000 μg，4℃放置4 h，取上清，作为鸭胚接种材料。

1.2.2 样品接种

将处理好的病料，经尿囊腔分别接种10日龄鸭胚，0.2 mL·胚-1，每个样品接种5枚，置37℃孵育观察。

1.2.3 胚液收获及传代

孵化至96 h取出，置4℃冰箱过夜，收取尿囊液。将收获的鸭胚尿囊液接种10日龄鸭胚，继续盲传2代，对于有凝集效价的样品，继续传代到10代。

1.2.4 血凝实验（HA）

对每次收获的鸭胚尿囊液进行血凝实验，按《兽药典》血凝实验方法进行。

1.3 病毒分离株（E10代）免疫学试验鉴定

1.3.1 琼脂扩散实验（AGP）

将含病毒鸭胚尿囊液，3 000 r·min-1离心30 min，取上清，并用0.2%甲醛灭活，以4 000 r·min-1离心2 h，弃上清，按原液量的1/10向沉淀中加入灭菌PBS，溶解沉淀，3 000 r·min-1离心30 min，取上清，作为AGP抗原。将制备的AGP抗原与购买的EDS76V阳性血清做AGP实验。

1.3.2 血凝抑制实验（HI）

分别用ND和EDS76病毒标准阳性血清与血凝阳性的鸭胚尿囊液进行HI实验。

1.4 病毒分离株（E10代）理化特性鉴定

1.4.1 热稳定性实验

取2份病毒液，每份0.5 mL，分别进行65℃、30 min和56℃、3 h处理，将2份处理过的病毒液和未经处理的对照病毒液分别接种10日龄的鸭胚，每个处理接种5枚，培养后收获病毒液，测定HA效价。

1.4.2 对乙醚和氯仿敏感性实验

取2份病毒液，每份0.5 mL，向其中1份加入1.0 mL乙醚，振荡10 min，置4℃过夜，挥发除去乙醚；向另一份病毒液加入氯仿0.025 mL，振荡后于4 ℃作用1 h后，3 000 r·min-1离心10 min，取上层病毒液。将2份处理过的病毒液和未经处理的对照病毒液分别接种10日龄的鸭胚，每个处理接种5枚，培养后收获病毒液，测定HA效价。

1.4.3 耐酸实验

取2份病毒液，每份0.5 mL，用0.1N的HCl将2份病毒液分别调pH至3和5，4℃与病毒作用2 h，用5%的NaHCO3将pH调回至7。将2份处理过的病毒液和未经处理的对照病毒液分别接种10日龄的鸭胚，每个处理接种5枚，培养后收获病毒液，测定HA效价。

1.5HS25分离株PCR鉴定

1.5.1 引物的设计与合成

根据GenBank登录的EDS76V标准株AV-127（登录号：NC_001813.1）的基因序列设计1对引物扩增HS25株PVⅢ基因的编码区，预计产物大小为0.753 bp。

P1：5'-cgcgccaatgcagcctgtgacc-3'

P2：5'-aacatattgaagagtacgatcag-3'

1.5.2 HS25株PVⅢ基因的扩增及克隆

病毒经过反转录后进行PCR扩增。反应条件为：94℃变性40 s，48℃退火40 s，72℃延伸60 s；运行5个循环后，继续按下列条件运行：94℃变性30 s，52℃退火30s，72℃延伸40s；运行30个循环后，72℃延伸10 min，4℃运行10 min。PCR产物经凝胶电泳鉴定，用核酸纯化试剂盒回收获得目的片断，并克隆到pMD18-T载体上，构建重组质粒pT-HS25。

1.5.3 HS25株PVⅢ基因核苷酸序列的测定

将经过鉴定的阳性质粒pT-HS25送到大连宝生物工程公司进行测序，测得的序列与GenBank上的EDS76标准株AV-127的相应序列进行同源性比较，比较两者之间的差异。

2 试验结果

2.1 病毒的分离

病料接种鸭胚传代不同代次尿囊液HA效价见表1。

表1 病料接种鸭胚传代不同代次尿囊液HA效价（1∶X）

将来自发病鸡场的3份输卵管病料混合处理后，经尿囊腔，接种5枚10日龄鸭胚。37℃培养96 h，收获尿囊液，继续盲传2代，每次接种5枚10日龄鸭胚。盲传2代后，出现血凝性，HA效价为1∶64～1∶256。将具有血凝性的病毒液继续传到10代。从第5代开始，血凝效价显著升高，HA效价达到1∶2 048～1∶10 240，到第10代，HA效价达到1∶40 960；鸭胚出现规律性死亡，到接种后96 h，死亡率可达70%，鸭胚出现明显病变，鸭胚的头、四肢、喙有明显的出血。将分离到的这株EDS76V命名为HS25株。

2.2 病毒分离株（E10代）的鉴定

2.2.1 HS25病毒的HI及AGP实验

HS25病毒的HI及AGP实验结果见表2。

表2 病毒分离株HS25（E10代）的HI实验和AGP实验结果

分别用ND和EDS76阳性血清对上述分离到的具有血凝性（HA）的HS25分离株做血凝抑制（HI）实验。结果为：HS25病毒只能抑制EDS76阳性血清，而不能抑制ND亚型血清。按标准方法制备成抗原，与EDS76阳性血清做AGP实验，可产生阳性沉淀线。

2.2.2 HS25病毒的理化特性

热稳定试验结果见表3。

表3 病毒分离株HS25的HI试验和AGP试验结果

病毒HS25株经过65℃、30 min处理后，接种鸭胚，经培养，尿囊液不再具有血凝特性；而病毒经56℃、3 h处理后，接种鸭胚，经培养，尿囊液仍然具有血凝特性。这说明病毒经65℃、30 min处理可以被灭活，能够耐过56℃、3 h处理。

对乙醚和氯仿敏感性试验结果见表4。

表4 病毒分离株HS25对乙醚和氯仿敏感性试验结果

病毒HS25株经乙醚和氯仿处理，接种鸭胚，与未处理的对照比，病毒的HA效价没有明显变化。这说明病毒能够抵抗乙醚和氯仿处理，病毒不含黏膜和脂质成分。耐酸试验结果见表5。

表5 病毒分离株HS25耐酸试验结果

病毒HS25株经pH5和pH3处理后接种鸭胚，与未处理的对照比，病毒的HA效价没有明显变化，说明病毒HS25株具有耐酸性。

2.2.3 HS25株病毒PVⅢ基因PCR的扩增和核苷酸序列的测定

HS25株病毒PVⅢ基因PCR的扩增和核苷酸序列的测定见图1～2。

图1EDSV HS25株PVⅢ基因PCR扩增产物

图2 EDS76的AV127株和HS25株PVⅢ基因片段核苷酸同源性

通过设计特异引物扩增HS25株病毒PVⅢ蛋白核苷酸，与预期的片段大小相同，并进行核苷酸序列测定。通过与EDS76V的标准株相应区域进行比较，核苷酸同源性96.7%。从而证明HS25株病毒是一株EDS76病毒。

3 结论

2005年从黑龙江省绥化市一鸡场分离到一株具有血凝性的病毒。经过HI实验、AGP实验、理化特性和PCR序列扩增及测序，证明是EDS76V。