饲料中黄曲霉毒素B1和呕吐毒素生物法降解研究进展

彭 俊，励 飞，刘 维，聂 勇

（湖南九鼎动物营养研究院有限公司，长沙 410007）

霉菌毒素主要是由真菌产生的具有毒性的次级代谢产物，广泛存在于粮食、饲用原料、动物饲料中，世界上每年约有25%谷物遭受各种霉菌污染，中国是霉菌毒素的重灾区。动物摄入含霉菌毒素食品会引起的急性或慢性毒性，损害机体的肝脏、肾脏、神经组织、造血组织及皮肤组织等。目前，已经发现霉菌毒素300～400种，其中与饲料密切相关的有黄曲霉毒素B1（AFB1）、单端孢霉烯族毒素（T2毒素、呕吐毒素）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、赭曲霉素（OTA）、烟曲霉素等，影响范围较广[1]。如何有效的去除饲料和饲用日粮中的霉菌毒素对动物的健康养殖至关重要。目前常用的去除霉菌毒素主要有微生物法、化学法和物理法，三种常用方法的措施、使用效果和优缺点见附表[2-10]。

附表 霉菌毒素脱毒方法和优缺点比较

由附表可知，目前去除霉菌毒素的物理方法和化学方法都有明显的弊端，而生物方法降解霉菌毒素具备效率高、安全、环保、成本低等优势，表现出独特的优势和广阔的研究前景。本文主要介绍饲料及其原料中污染率和污染水平最高的两种霉菌毒素（AFB1和DON）的特点、危害和致毒机制以及生物脱毒方面的研究进展。

1 黄曲霉毒素B1

1.1 特点和致毒机制

黄曲霉毒素（AFT）是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的次级代谢产物，其主体结构为二呋喃环和香豆素[11-13]。目前经鉴定出的黄曲霉毒素有20多种，主要分为B族、G族和M族等，毒性最强的是AFB1，早在1993年世界卫生组织国际癌症研究署将AFB1定为一级致癌物[14-15]。AFB1（分子式为C17H12O6，相对分子质量为312.06）分布广泛、化学性质稳定，也是目前世界公认为天然毒性最强的物质之一，一般的高温和强酸条件难以将AFB1降解，只有在高温268～269℃和低pH 1.0～3.0时才有少量降解[16]。但是，AFB1在碱性环境（pH 9.0～10.0）时会迅速被分解，此外AFB1不溶于水，但易溶于乙腈、丙酮、甲醇等[17]。目前，对AFB1的毒性研究主要包括致癌毒性、免疫毒性、生殖毒性和神经毒性等，基本毒性单位是二呋喃环，其氧杂萘邻酮的结构具有极强的致畸和致癌作用[18]。AFB1经细胞色素氧化酶的作用形成的代谢物AFB1-8,9环氧化合物及之后与DNA、RNA和蛋白质的共价结合是其发挥毒性作用的主要机制[19]。AFB1的主要靶器官是肝脏，动物摄入AFB1后往往会引起发热、食欲减退、厌食和腹泻等，发展严重会引发急性肝炎、肝细胞坏死、肝充血等症状更严重会引发肝癌[20]。

1.2 生物吸附法脱除AFB1

采用生物吸附方式脱除AFB1与菌体本身的性质有关，如微生物的细胞壁等。研究发现，真菌类和乳酸菌类对AFB1的吸附效果较好，Bovo等通过喷雾干燥和冷冻干燥处理灭活的鼠李糖乳杆菌，并用两种干燥后的菌体分别吸附处理AFB1，研究发现喷雾干燥过程中因破坏了细菌细胞壁的结构和功能而完全丧失AFB1的吸附能力，而在冷冻干燥过程中未破坏细胞壁，仍保持吸附AFB1的能力[21]。用于吸附AFB1的细菌中，乳酸菌是被研究最为广泛的，主要是通过乳酸菌细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺为主要成分的肽聚糖对AFB1进行物理吸附。此外，干酪乳杆菌对用于吸附壁AFB1的吸附率为49.2%，主要是其细胞壁产生胞壁酸的作用效果，开菲尔乳杆菌（Lactobacillus kefiri）同样对AFB1有很强的吸附能力[22]。目前，研究酵母菌对AFB1的吸附少有报道，禹山林等从16株益生菌中筛选到一株吸附效果最佳的酿酒酵母对AFB1的吸附率是81.16%，试验表明了其是通过物理方式结合，可通过离心等方式去除，可广泛应用作饲料添加剂[23]。

1.3 生物降解法脱除AFB1

采用生物降解方式脱除AFB1主要是微生物发酵代谢产物或分泌的酶系破坏毒素的结构，使毒素变为无毒或者低毒产物。孙粮等选出一株对AFB1降解率达到91.8%菌株（将AFB1降解为两个未知物质P1和P2），经测序定种为地衣芽孢杆菌，并将该菌株的发酵液分为上清液和菌悬液分别用于降解AFB1，结果表明，降解AFB1的活性成分在上清液中，并初步验证该活性物质是一种胞外酶[24]。王明清等分离到一株蜡样芽孢杆菌，分析其胞外上清液、菌悬液和胞内液对AFB1的降解率分别是91.7%、11.4%和7.6%，该试验也表明起作用活性物质主要位于胞外液[25]。Wang等获得了一种新型嗜热复合菌系TADC7，由Geobacillus、Clostridium等细菌构成，能在高温下降解高浓度的AFB1，在120 h内可将0.5 μg·mL-1的AFB1彻底降解，并表示TADC7的上清液起主要解毒作用，这种可彻底降解毒素且耐高温和高浓度的复合菌系的研究和应用前景广阔[26]。目前已发现多种细菌和真菌对AFB1有脱除作用，包括枯草芽孢杆菌、恶臭假单胞菌、绿脓杆菌、假蜜环菌、黑曲霉等。研究表明，降解AFB1的活性物质为微生物分泌的蛋白酶系，提取细菌和真菌的发酵粗提液降解AFB1也被广泛研究。已知的降解AFB1的酶已从不同种类的微生物中被提取纯化，并应用于食品和饲料中，包括漆酶、AF氧化酶（AFO）、辣根过氧化物酶、锰过氧化物酶（MnP）、F420H2依赖性还原酶（FDR）等。

2 呕吐毒素（DON）

2.1 特点和致毒机制

镰孢霉毒素主要由镰孢菌、头孢霉、漆斑菌等产生，其中最重要、数量最多的毒素是单端孢霉烯类毒素（TS），该类毒素包含一百多种化合物，大致分为A类、B类等4个亚类。A类包括T-2毒素、HT-2毒素等，B类包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇，又名呕吐毒素（DON）、雪腐镰孢菌烯醇（NIV）和镰孢菌烯酮-X等[27]。呕吐毒素（分子式为C15H20O6，相对分子质量为296.32）对谷物饲料的污染范围和对动物的健康危害程度居于单端孢霉烯类毒素之首，易溶于水、乙醇等极性溶剂，和AFB1类似的是：酸性环境、高温很难破坏其化学结构，而在偏碱性条件下高温可迅速破坏其化学结构。DON化学式为3a,7a,15-三羟基-12,13-环氧单端孢霉-9稀-8酮，其12,13-环氧环为毒性基团，可与核糖体结合，造成核糖体毒性压力效应，激活多种蛋白激酶，调节基因表达，抑制蛋白合成并产生细胞毒性，对动物的免疫功能、繁殖功能产生明显的影响[28-29]。摄入低剂量的DON会导致动物出现厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳和反应迟钝等急性中毒症状，严重时造成骨髓组织的坏死和内脏器官的出血、母畜不孕或流产以及死亡。

2.2 生物吸附法脱除呕吐毒素

采用生物吸附法脱除DON，也与生物法吸附AFB1类似，主要是真菌类和乳酸菌类对呕吐毒素的吸附效果较好。Shetty等研究酵母菌和乳酸菌对毒素吸附机制发现主要是这两类微生物的细胞壁与毒素结合，吸附效果与菌株直接相关[30]。Repecˇkiene˙等研究发现，发酵地霉酵母、美极梅奇酵母、酿酒酵母、马克思克鲁维酵母4种酵母对DON具有良好的吸附效果[31]。Niderkorn等研究29种乳酸菌和丙酸菌对DON的脱除效果，其中有6种有效果，脱除效果与细菌浓度和细菌种类有关，但同样的细菌浓度，丙酸菌对DON的清除能力低于乳酸菌；活细菌与死细菌对DON的清除能力没有显著性差异[32]。Garda-Buffon等研究发现，丝状真菌米曲霉和米根霉可将DON吸收到菌丝体上，通过深层发酵降解DON，且降解速率在48 h后达到最大[33]。还有研究表明，罗伊乳杆菌的发酵液可抑制镰刀菌孢子萌发从而减少DON的积累，鼠李属乳酸菌株和费氏丙酸杆菌株和DON混合可吸附64%～93%的DON[34-35]。

微生物吸收DON的原理主要与葡甘露聚糖在细胞壁上有关，目前从真菌细胞壁提取的葡甘露聚糖的解毒剂已广泛应用于饲料行业。微生物菌体细胞壁对DON吸附是可逆性的，DON的吸附作用与细菌的种类及浓度有关，因此需要进一步改善吸附剂的质量和稳定性[36-37]。

2.3 生物降解法脱除DON

采用生物降解法脱除DON，主要是通过微生物释放胞外酶等作用于毒素分子，使其羟化、水解、去环氧化、脱乙酰和糖苷化而分解转化为低毒化合物[38]。这些微生物主要包含德沃斯氏菌属、诺卡氏菌属、动物肠道内的厌氧细菌、芽孢杆菌和真菌等。Shima等从土壤中筛选到一株土壤杆菌属根瘤菌（Agrobacterium Rhizobium）E3-39，该菌胞外提取液分泌的一种胞外酶，24 h可将培养基中200 μg·mL-1的DON代谢为3-keto-DON[39]。徐剑宏等从土壤和麦穗样品中分离到一株德沃斯氏菌（Devosia insulae）DDS-1，该菌株对液体培养基中DON降解率＞95%，对小麦饲料中DON降解率达75.47%，研究发现，该菌株可产生一种氧化酶（3-acety-DON，该胞内酶具有较好的温度和酸碱稳定性），将DON的结构氧化为低毒化合物[40]。Khatibi等比较来自于7种镰刀菌的3-O-乙酰基转移酶的特征，筛选出两种最优3-O-乙酰基转移酶基因片段FgTRI101和FfTRRI201，并将其克隆到酿酒酵母中成功表达，表达产物可有效降低DON含量[41]。Fuchs等从牛瘤胃中分离到一株厌氧优杆菌属细菌BBSH797，该菌可将DON代谢成单一产物DOM-1（DOM-1的毒性仅为DON的1/55），已被商业开发为饲料脱毒剂[42-43]。He等使用高浓度DON作为选择性压力，从土壤样品中分离到一株塔宾曲霉NJA-1，NJA-1菌株初酶液体外可转化94.4%的DON，目前塔宾曲霉NJA-1已申请专利被开发为微生物脱毒制剂[44]。目前不同的微生物发酵的胞内液和胞外液对DON降解研究较广泛，但其中起作用的具体化合物的基础研究却少有报道。

3 总结与展望

目前利用微生物本身或其产生的脱毒酶对AFB1和DON的降解来消除或者降低其危害是目前解决该两种毒素的有效途径和研究热点，主要针对降解AFB1和DON菌株的筛选、鉴定和脱毒条件和方式的优化，但对脱毒物质的分离、纯化、降解产物的获得以及降解产物的相关基因序列和其毒理学研究相对较少。AFB1、DON、ZEN等毒素在饲料及其原料中往往都不是单独存在，只是不同毒素的含量存在差异，较多学者的研究是以单一毒素降解为目的进行试验，对同时降解两种或多种霉菌毒素的研究少有报道。

微生物能降解AFB1和DON，主要是微生物代谢产生的胞内酶和胞外酶起作用，因此今后的研究可更深入研究降解AFB1、DON的胞内酶或胞外酶的分离纯化以及获取关键酶的基因序列，应用基因工程方法对基因进行改造，使其关键酶活提高。再应用基因工程方可将改造优化后降解AFB1、DON等霉菌毒素的关键酶的目的基因转入其菌体可吸附霉菌毒素的酵母菌或者细菌中，构建双重高效降解AFB1、DON等霉菌毒素且其菌体可吸附霉菌毒素的工程菌，并应用到饲料及其原料的脱毒产业中。除构建工程菌外，分别筛选高效脱除AFB1和DON的微生物，按照一定比例将两种及以上微生物组合复配，并优化复配比例，构成复合微生物菌系使其可稳定、高效脱除AFB1、DON等霉菌毒素。研究脱除饲料及其原料中霉菌毒素的工作意义重大，不仅可提高动物饲料安全，而且可减少粮食浪费，对我国动物饲养行业和农业的长足稳定发展影响深远。