一株具有抑菌活性的凝结芽孢杆菌的筛选、鉴定及其抗逆性研究

韩明渠，李富伟，潘兴亮，王玉田，郑瑞峰

（1.北京科为博生物技术研究院，北京 100086；2.北京市畜牧总站，北京 100101）

对饲用抗生素的限制使用已经成为国际社会的共识，“饲料禁抗”是国际畜牧饲料行业发展的必然趋势。欧盟早在2006年就颁布法令禁止抗生素在饲料中使用，亚洲的日本和韩国也分别在2008年和2011年禁止在饲料中使用抗生素[1]。美国在2017年也开始限制在饲料中使用抗生素[2]。2019年我国农业农村部发布第194号公告，促生长类药物饲料添加剂将在2020年全部退出。亟需寻找绿色、安全、高效的抗生素替代品，微生物制剂产品成为国内外研究热点。

凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）属于革兰氏阳性菌，产芽孢，发酵后可产生大量的乳酸，属于肠道乳酸菌，被称为“有孢子性乳酸菌”[3]。凝结芽孢杆菌具有一般乳酸菌维持动物肠道微生态平衡、提高动物机体免疫力、提高动物生产性能等作用。同时，由于能产生芽孢，抗逆性强，耐高温，耐贮存，易于饲料加工，目前中国、美国和欧盟等国家均已将该菌种列入可在畜禽饲料中添加的益生菌[4]。本研究通过MRS培养基平板钙溶圈法初筛，结合琼脂扩散牛津杯法进行抑菌性能评估复筛，旨在从鸡肠道及内容物中筛选具有抑菌作用的凝结芽孢杆菌菌株。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品

鸡肠道及内容物样品。

1.1.2 培养基

加富MRS培养基：胰蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，酵母粉5 g，葡萄糖5 g，无水氯化钙0.15 g，氯化钠2.5 g，硫酸锰0.1 g，L-半胱氨酸0.5 g，蒸馏水1 000 mL，pH 5.2，121℃灭菌30 min。固体培养基添加2%琼脂。

MRS碳酸钙培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g，吐温-80 1 mL，磷酸氢二钾2 g，乙酸钠5 g，柠檬酸二铵2 g，硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.05 g，碳酸钙6 g，pH 6.0，蒸馏水1 000 mL，121℃灭菌30 min。固体培养基添加2%琼脂。

LB培养基：蛋白胨1.0 g，酵母浸粉0.5 g，NaCl 1.0 g，加蒸馏水至100 mL，pH 7.0，121℃灭菌30 min。固体培养基添加2%琼脂。

人工胃液：取胃蛋白酶1.0 g溶于100 mL无菌水中，用9.5%～10.5%的盐酸调节pH到3.0。

人工肠液：称取磷酸二氢钾6.8 g，加无菌水500 mL溶解，用0.4%的氢氧化钠溶液调pH至6.8，加水稀释至1 000 mL，每100 mL液体中加入1.0 g胰蛋白酶，加入不同量的猪胆盐，混匀，胆盐浓度分别为0.1%、0.3%和0.6%。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株筛选

初筛：称取鸡肠道及内容物样品1.0 g，放入装有玻璃珠的无菌250 mL三角瓶中，加入99 mL无菌水，220 r·min-1振荡30 min。然后进行10倍梯度稀释，选取适宜稀释度涂布在加富MRS培养基固体平板，40℃培养48 h。待菌落长出后，挑取菌落接种到MRS碳酸钙培养基固体平板上，37℃培养48 h，挑取产生钙溶圈的菌落，转接斜面培养基，于4℃冰箱保存备用。

复筛：将从样品中划线分离出的菌株，分别接种于MRS液体培养基中，37℃，180 r·min-1，培养48 h。以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为病原指示菌，采用琼脂扩散牛津杯法评估各菌株的抑菌能力，筛选抑菌能力强的菌种。

1.2.2 菌种的鉴定

1.2.2.1 形态学鉴定

观察划线纯化后的菌落形态，并进行革兰氏染色镜检。

1.2.2.2 生理生化鉴定

参照《常见细菌系统鉴定手册》进行生理生化实验[5]。

1.2.2.3 分子生物学鉴定

gyrB基因的PCR扩增与测序：以基因组DNA为模板PCR扩增gyrB基因，扩增引物采用gyrB-F（5'-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGG NAARTTYGA-3'）和gyrB-R（5'-AGCAGGGTACGGAT GTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3'）（生工生物工程股份有限公司合成）[7]。PCR反应体系（20 μL）：10×Buffer 2 μL，dNTPs 2 μL，10 mol·L-1引物1 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，DNA模板1 μL，ddH2O补足至20 μL。PCR反应程序为：95℃预变性5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，32个循环，最后72℃10 min，扩增的PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。

基因序列测定及系统发育分析：扩增产物序列测定由生工生物工程股份有限公司完成。将所得序列在GenBank数据库中进行BLAST，然后选择相似性较高的模式菌株序列，利用MEGA 6.0软件进行多序列同源性比对，用邻位相连法（NJ法）构建系统发育树，并进行1 000次重复的Bootstraps统计学检验。

1.2.3 抗逆性研究

菌株人工胃液的耐受性：将菌株CA04121培养物接种于人工胃液中，分别在静置0、60、120、180 min进行活菌平板计数。

菌株胆盐的耐受性：将菌株CA04121培养物接种于不同胆盐浓度（0、0.1%、0.3%、0.6%）的人工肠液中，分别在静置6 h后进行活菌平板计数。

2 结果与分析

2.1 具有抑菌活性凝结芽孢杆菌的筛选

通过加富MRS培养基和MRS碳酸钙培养基固体平板初筛，抑菌能力评估复筛，得到4株可以产酸并具有抑菌活性的芽孢杆菌菌株，抑菌效果见图1。其中，菌株CA04121对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有较强的抑制作用。

图1 抑菌效果图（左图病原指示菌为金黄色葡萄球菌，右图病原指示菌为大肠杆菌）

2.2 菌种鉴定

2.2.1 形态特征

在MRS培养基平板表面上，菌落呈圆形，乳白色，不透明，有明显钙溶圈；革兰氏染色呈阳性，细胞呈杆状，两端钝圆，芽孢端生，见图2。

2.2.2 生理生化特征

接触酶和V-P测定反应均呈阳性，可在50℃温度条件下生长，生理生化试验结果见表1。

2.2.3 gyrB基因序列系统进化分析

菌株CA04121的gyrB基因测序结果在GenBank中进行Blast比对分析，其序列全长为1 184 bp，与芽孢杆菌属的gyrB基因序列相似性最高。选取Paenibacillus amylolyticus BCRC 14684（EU272024）作为外类群，利用Mega 6.0软件构建菌株CA04121与芽孢杆菌属部分模式种gyrB基因系统发育树，见图3。菌株CA04121与Bacillus coagulans B10（MH427055）同处一个进化分支，亲缘关系最近。

表1 生理生化特征

图3 gyrB基因序列系统发育树

通过菌落形态特征、生理生化特征以及gyrB基因序列的系统发育分析结果，将菌株CA04121鉴定为凝结芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），该菌种已保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC NO.16244。

2.3 抗逆性能研究

2.3.1 耐酸性能

CA04121菌株在人工胃肠液中的存活率见表2。

表2 CA04121菌株在人工胃肠液中的存活率

由表2可知，在人工胃液中静置60min，存活率可达90.9%，静置180 min后存活率仍可达72.7%。该凝结芽孢杆菌菌株具有较强的耐酸能力，能耐受胃酸环境，为其益生特性的发挥奠定重要基础。

2.3.2 耐胆盐性能

凝结芽孢杆菌胆盐耐受力见表3。

表3 CA04121菌株在不同浓度胆盐溶液中的存活率

在胆盐浓度为0.1%时，菌株存活率达到86.4%，在胆盐浓度为0.3%时，菌株存活率达到68.2%，而在胆盐浓度为0.6%时，菌株存活率仍可达到54.5%。因此，该菌株具有良好的耐胆盐能力。

3 讨论与结论

本研究通过MRS培养基平板钙溶圈法初筛，结合琼脂扩散牛津杯法进行抑菌性能评估复筛，从鸡肠道及内容物中得到一株对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有较强抑制作用的菌株CA04121。通过形态特征、生理生化特征以及gyrB基因进化分析结果，鉴定为凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）。该菌种具有较好的产酸性能，同时具有较强的抑菌能力。这与严涛等从泡菜中分离的凝结芽孢杆菌及赵丽娜从健康仔猪盲肠及粪便中分离的凝结芽孢杆菌[的研究结果基本一致[7-8]。通过抗逆性能研究，该凝结芽孢杆菌菌种在模拟胃液中处理180 min存活率可达到72.7%，在0.6%的胆盐溶液中处理6 h存活率达到54.5%，结果表明，其可以较好地适应动物肠道环境。下一步需进行该菌种的工业化生产及其在动物养殖试验等方面研究，充分发挥其在动物养殖过程中调整动物肠道健康、替代抗生素抑制有害菌等方面的应用潜力。