高效液相色谱—串联质谱法测定鸡肉中的氯霉素

徐少华，黄 婷

（深圳市农产品质量安全检验检测中心广东省市场监督管理局食用农产品监管重点实验室，广东 深圳 518005）

全氯霉素是一种抑制性的广谱抗生素，可以抑制骨髓细胞中蛋白质的合成，对人类和动物的骨髓细胞和肝细胞具有毒性作用，不仅可引起细胞减少性贫血、血小板减少和再生障碍性贫血，还可导致严重的胃肠道反应、二重感染等[1-2]。长期微量摄入氯霉素不仅使沙门氏菌、大肠杆菌等产生耐药性，还会导致机体正常菌群失调，使人们易患各种疾病。随着人们生活水平的提高，动物性食品的食用安全越来越受关注。世界上很多国家都对其作出了规定，我国在农业部235号公告中也明确地将氯霉素列为禁用药物。目前监测氯霉素类药物残留的方法主要有高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、超高效液相色谱-质谱联用法和酶联免疫法[3-6]等。现有的氯霉素类药物检测方法前处理往往比较复杂，消耗试剂较多，检测周期长成本高。本研究建立了一种针对鸡肉中氯霉素的液相色谱—串联质谱的检测方法。本方法减少试剂用量、改善提取液净化步骤，简单快捷、灵敏度高，可以检测市场上鸡肉中氯霉素的含量，对质量检测方法的进步和市民的身体健康有重大意义。

1 材料与方法

1.1 设备与仪器

液相色谱—串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）（美国Agilent LC 1290/Sciex 5500）；电子天平（感量0.01 g、感量0.000 1 g）（梅特勒电子天平）；高速离心机（美国sigma公司）；固相萃取装置；超声波清洗仪；可控温氮吹浓缩仪；涡旋振荡器。

1.2 试验材料

水符合GB/T 6682规定的一级水；标准物质：氯霉素（氯霉素、氯霉素-D5）纯度≥99.6%，购自德国DR公司；试剂：甲醇（CH3OH）、乙腈（CH3CN）、甲酸（HCOOH），色谱纯：均购自德国默克公司；溶剂：乙腈水溶液：80%乙腈水+0.2%甲酸；甲醇水溶液：10%甲醇水+0.1%甲酸；滤膜：水相，0.22 μm（上海安谱）；PRIME HLB（6 cc 200 mg）固相萃取柱（美国Waters）。

1.3 试剂配制

标准储备液：每种标准物质均用甲醇配制成1.00 mg·mL-1，在-18℃条件下于棕色瓶中保存，有效期为6个月。

标准中间液（1.00 μg·mL-1）：将标准储备液用甲醇逐级稀释成1.00 μg·mL-1标准中间溶液，在-18℃条件下于棕色瓶中保存，有效期为3个月。

内标工作液（100 ng·mL-1）：准确吸取氯霉素-D5内标中间溶液1.0 mL，用甲醇稀释并定容至10 mL，在4℃条件下于棕色瓶中保存，有效期为3个月。

标准工作液：根据药物的灵敏度和仪器线性范围，用乙腈水溶液配成不同浓度的混合标准工作溶液，现配现用。

2 试验方法

2.1 仪器条件

2.1.1 液相色谱条件

色谱柱：BEH C18（100 mm×3.0 mm，1.7 μm）（美国waters公司）；流速：0.30 mL·min-1；柱温：40℃；进样量：5.0 μL；

流动相及梯度洗脱程序见表1。

表1 氯霉素药物流动相梯度洗脱

2.1.2 质谱参考条件

离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应离子监测（MRM）；电喷雾电压（IS）：-4 500 V。

离子源温度（TEM）：550℃；气帘气CUR：35 psi；碰撞气压力CAD：8 psi；喷雾气GS1：55 psi；辅助加热气GS2：55 psi；药物保留时间、定性定量离子对及去簇电压（DP）、碰撞电压（CE）见表2。

表2 氯霉素药物及氯霉素内标的CAS号、保留时间、定性定量离子对及去簇电压（DP）、碰撞电压（CE）

2.2 前处理

2.2.1 提取

称取试样2 g（精确到0.01 g）于50 mL离心管内，加入100 ng·mL-1的内标工作液（1.3.3）40 μL，加乙腈水溶液（1.2.6）10 mL，震荡摇匀30 s，超声波清洗仪超声5 min，高速离心机6 000 r·min-1离心6 min。

2.2.2 净化

于上述离心后提取液中移取3.5 mL上清液，直接过6 cc规格PRIME HLB固相萃取柱（6 cc，200 mg），保持速度1 s·滴-1。用玻璃小管收集全部流出液, 准确移出2.5 mL至15 mL带刻度小管内。流出液在40℃水浴下氮气吹0.5 mL。残留液用甲醇水溶液（1.2.7）定容至1.00 mL，过0.22 μm水相滤膜，待上机测定。

2.3 标准工作曲线的制备

精密量取氯霉素药物的标准溶液适量，用相应的空白样品基质提取液制备混合标准浓度系列：氯霉素浓度为 0.10、1.00、5.00、20.0、100 μg·L-1，供液相色谱—串联质谱仪测定，并根据试剂浓度和响应的峰面积制备标准工作曲线。

2.4 试验灵敏度、回收率和精密度的测试

本试验以鸡肉样品为基质，添加浓度为0.2 μg·kg-1，按照上述方法进行前处理和测定，平行样品n=6，根据各样品检测值，计算出方法检出限（MDL），计算公式见式1。

其中k为置信因子取3。本试验通过阴性样品加标实验，根据加标样品检测值与加标浓度比值计算实验回收率。再通过平行加标实验，计算出试验的精密度，用于评估实验误差和稳定性。

2.5 结果计算

本试验以内标方法单点校准进行定量测定，计算出试样中的氯霉素药物的含量，计算公式见式2。

式中，X-试样中待测组分残留量（μg·kg-1）；CS-标准工作溶液浓度（ng·mL-1）；V1-试样提取体积（mL）；V2-试样移取体积（mL）；V3-试样定容体积（mL）；m-样品称样量（g）；A-样液中待测目标物的峰面积；AS-标准工作溶液的峰面积；Asi-标准工作溶液中内标物的峰面积；Ai-样液中内标物的峰面积。

注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，结果保留3位有效数字。

3 试验结果

3.1 高效液相条件确定

为寻找分离度好，灵敏度高，峰形尖锐的液相条件，参考相关文献及检测标准，选用ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm，3.0 mm×100 mm）色谱柱，柱温为40℃，采用乙腈和水作为流动相，进行梯度洗脱。进样流速为0.30 ng·mL-1时，氯霉素响应强度1.3×103，背景基线非常低，峰形尖锐，保留时间适中，可有效进行氯霉素药物的定性定量检测。

图1 阴性样品添加0.1 ng·mL-1氯霉素离子通道色谱图

3.2 前处理方法的确定

由于鸡肉呈现纤维状，所以需要用本方法先将鸡肉做粉碎处理，选用乙腈水溶液作为提取液，超声离心后可以充分提取氯霉素药物，其中试剂也起到了稀释的作用，有利于降低其他成分对于仪器检测的干扰，并且提高仪器检测的灵敏度。

3.3 线性范围和方法检出限

按照方法条件设置参数，配置一系列不同浓度的标准样品溶液（0.10、1.00、5.00、20.0、100 μg·L-1），待仪器稳定之后，对系列标准样品溶液进行测定，绘制其标准曲线，相关系数为r=0.999。

以鸡肉样品为基质，添加浓度为0.2 μg·kg-1，按照上述方法进行前处理和测定，平行样品n=6，根据各样品检测值（0.18、0.20、0.20、0.16、0.20、0.18 μg·kg-1，计算出平均值X（0.187 μg·kg-1）及标准偏差Sb（0.0164），当被分析物的回收率在70%～120%时，可计算方法检出限为0.05 μg·kg-1。

图2 阴性样品添加0.1 ng·mL-1氯霉素-D5离子通道色谱图

3.4 方法精密度和回收率实验

以鸡肉样品为基质，进行六组平行加标回收试验，加标浓度分别为0.2、1.0、2.0 μg·kg-1。将加标样品和空白样品按前述方法进行处理，上机测试，加标试验回收率范围分别为80%～100%、88%～100%、93～100%。结果见表3。

表3 加标回收试验精密度和回收率

4讨论

本试验讨论建立鸡肉中氯霉素药物高相液相色谱串联质谱的测定方法。该方法通过乙腈水溶液提取，离心氮吹的处理步骤。最终建立的方法检出限达到 0.05 μg·kg-1，线性范围为 0.1～100 μg·L-1，其相关系数r=0.999。鸡肉样品在0.2、1.0、2.0μg·kg-13个水平添加回收实验条件下，回收率为80%～100%，相对标准偏差RSD为2.67%～8.81%。该方法具有分析过程简单、稳定性好、定量准确等优点，能满足鸡肉中常见氯霉素药物快速定性定量检测的要求。