第28届国际生物学奥林匹克竞赛试题 实验3·发育生理学

张雁云 王戎疆 杜 军 范六民 佟向军

（1 北京师范大学生命科学学院 北京 100875 2 北京大学生命科学学院 北京 100871 3 中国人民大学附属中学 北京 100080）

总分：100 分 时间：120 min

本实验考试在2 h 内完成2 个问题。请按照给出的顺序完成任务，第2 题中的幼虫将在考试开始后30 min 提供。

问题1：识别蝇幼虫的组织（45 分）。

任务1a 和b：识别幼虫的体轴（7 分）；

任务1c、d 和e：解剖红头丽蝇（Calliphora vicina）幼虫，分离和识别组织（38 分）。

问题2：幼虫心脏的生理学（55 分）。

任务2a、b 和c：解剖红头丽蝇幼虫暴露搏动的背血管（幼虫心脏）（10 分）；

任务2d、e 和f：设计并完成实验，已确定作用于背血管的3 种药理学试剂的活性（45 分）。

本实验测试解剖技能、观察和实验设计能力。

重要提示：

●请记住在给定的框中写下你的姓名、学生代码和国家；

●请在答题纸上写下答案，将你的解剖标本置于6 孔显微镜载玻片上，答题纸和载玻片都将会被收走；

●确定已收到列出的所有材料和设备；如果缺少任何物品，请立即举红卡示意；

●实验过程中，请确保妥善处理设备和用具；由于你自己的原因造成溶液泼洒或损坏设备，将不予补充；

●在考试结束哨声响起时，请立即停笔；

●将你的绘图纸和白纸用夹子夹在答题纸上，并放入提供的信封中；确保将你的身份识别小标签贴在6 孔显微镜载玻片的白色部分上；

●不得将任何纸张、材料或工具等带出实验室；

●英文原件可应要求提供。

材料和工具

1 台体视显微镜（解剖镜）；1 个台灯；2 把解剖镊子；1 把精细镊子，用于移动幼虫；管中有10条死的幼虫，已用乙酸乙酯处理过夜（任务1）；如果需要，可提供更多；玻璃培养皿内有10 只麻醉的幼虫（任务2），已用乙酸乙酯处理1 h；这些幼虫将在需要时提供；2 个底部装满黑色硅胶的塑料解剖盘；每个解剖盘边缘约有20 个细针，使用时用解剖镊子移动并将其插入黑色硅胶；1 支1 000 μL 移液器及吸头；1 支200 μL 移液器及吸头；3 个1.5 mL Eppendorf 管，标记为A、B 和C，分别装有乙酰胆碱、肾上腺素和章鱼胺；1.5 mL Eppendorf 管用于装稀释液；100 mL PBS（磷酸缓冲液）；Gelvitol 胶液（衬托介质）；计数器；1 个定时器；有6 个疏水孔的载玻片，疏水孔标记为1～6（不要接触疏水孔）；纸巾；1 支记号笔；1 张绘图纸；1 张白纸；1 个曲别针；1 面红旗（若色盲症识别为深色）；1 面绿旗（若色盲症识别为浅色）。

问题1：识别幼虫的器官

前言：

丽蝇科（Calliphoridae）是典型双翅目类群。幼虫的形态特征虽然通常与成虫不同，但也有许多与成虫类似的结构特征。在第1 组实验中，你需要鉴定红头丽蝇幼虫阶段中的组织。

图1 红头丽蝇三龄幼虫（发育阶段）的侧面观，左侧是前面

肛区前面是气门区，有一对棕色环形的气门，里面有一些棕色裂缝，空气从此进入气管系统。

在体视显微镜下进行解剖，可观察到幼虫内部组织的结构，如图2所示。对实验1 重要的结构有神经系统、脂肪体、消化系统、气管系统和成虫盘。成虫盘是离散的上皮细胞片，在变态后形成成体的外骨骼。

图2 高度衍生的双翅目幼虫前端内部结构的侧面观

图3 一种双翅目幼虫的背面观（不是红头丽蝇）

在上图中，脂肪组织未显示。图4显示了2 个用所给材料不完全制备的标本，给出的解剖标本中没有颜色和阴影。

图4 原位解剖

任务1a

图1和图5显示了红头丽蝇的外部形态。将死的幼虫置于黑色硅胶解剖盘上，观察外部结构。通过你的观察和上述图表，确定幼虫的前、后端及上部（背面）和下部（腹侧）。

任务1b

i）在图5相关的方框中，分别填入一个识别数字（1，2，3 或4），用来表明图中幼虫的身体位置。数字可重复使用：1=腹面前部，2=腹面后部，3=背面前部，4=背面后部。

ii）将2 个图片中间的3 个符号（i，ii 和iii）与2 图中对应的结构划线连接起来（1 个符号对应1个图中的结构即可）。

图5 红头丽蝇幼虫外部结构

任务1c

识别相关结构，简单测量后，将特定的结构转移至六孔载玻片上。建议在体视解剖镜下使用镊子完成所有操作。

重要提示：移动细针只能在体视解剖镜下观察并使用镊子完成。当将细针插入组织时，要确保镊子靠近细针的锐端而非上部，否则容易导致细针弯曲，而难以完成操作。始终使用2 把镊子操纵幼虫和细针。

保护好镊子和标本。不要插入幼虫太深，也不要总是向侧方或上方从标本上撕离组织。看起来如图4A 所示。

一般解剖说明：

1）使用任务1a 中的幼虫或用1 只新的虫子，将幼虫背面朝上置于黑色硅胶盘上，体视解剖镜下观察和解剖。使用解剖镊子夹取一根细针，将其插在气门之后幼虫后端的肛部。用镊子轻轻地拉伸幼虫的前端，将针插在口器之后。

2）使用2 把镊子夹起最后2 个后刺带间的体壁并撕开，第1 次撕裂是最难的。可把幼虫身体后端朝向你，用2 把镊子将其撕开。

3）通过移液器轻轻将PBS 液体覆盖制备标本。

4）用镊子沿中线撕开体壁，从后向前撕。仔细地将每个镊子的2 个尖端分别放在体壁之下和之上，通过夹紧和拉动轻轻撕裂体壁。在每撕开一个体节的体壁后，重新调整镊子的位置。最后将解剖盘转过来，同样撕开体壁，直至身体后部插针的部位。

5）将体壁伸展开，并钉在黑色硅胶上，暴露出内部结构。用一把镊子拉住体壁和肌肉，用另一把镊子将针插上。这时看起来像图4B。

6）去除多余的脂肪，注意不要破坏脑和肠。用一把镊子夹起脂肪，将其从组织上移除，或取出置于解剖盘的一侧。

注意：为准备下一步实验，在载玻片的每个疏水孔中加1 滴gelvitol 胶液。从解剖盘转移组织至载玻片时，要让组织保持浸润在一些液体中，液体的表面张力作用会在镊子的尖端留一些液体。在载玻片疏水孔gelvitol 胶液中打开镊子，组织会转移至gelvitol 胶液中。

任务1d

1）取下嗉囊，加在载玻片的位置1 上。在表1中填写出嗉囊是在脑的前方还是后方连接至消化系统上。

2）找到唾液腺，取出其中的一个置于载玻片位置2 中，估计唾液腺长度与体长的比值，并将其填写在表1中。

3）轻轻地解剖出脑，去除气管并断开周围附着的神经。将脑置于载玻片的位置3，计数脑发出的神经总数，将其填写在表1中。

4）解剖出1 个后部气门，要连着一小段气管。置于载玻片的位置4，在表1中填写一个气门上狭缝数量。

5）取出口器，仔细剥离多余的肌肉，将口钩与口器其他部分彼此分开。将2 个口钩置于加有一滴胶液的载玻片位置5。利用透射光仔细观察一个口钩上的齿数，记录在表1中。

6）找到并解剖1 个翅原基，小心地将其置于载玻片位置6。

7）重要信息：你必须将识别标签牢固地黏贴在载玻片的白色区域，载玻片将在考试结束时收集并给分。

任务1e

将依据胶液中放置的组织是否正确、是否完好无损及下表中的答案给分。

表1 幼虫组织识别记录表（38 分）

问题2：幼虫心脏的生理反应

前言：在玻璃培养皿中的幼虫已被致死剂量的麻醉剂处理过。但在短时间内，这些动物的组织仍可对一些药物产生反应，反应方式类似于哺乳动物，但也会有所不同。你需要证实下列3 种药物对于背血管搏动的作用：乙酰胆碱（A）、肾上腺素（B）和章鱼胺（C）。在昆虫中背血管推动血淋巴在开管系统中的循环，所以相当于哺乳动物的心脏。有类似的基因在昆虫和哺乳动物的发育中都是需要的。一些哺乳动物激素和神经递质可通过同源的受体蛋白而直接在昆虫组织上产生作用。

任务2a

准备好后，举起绿旗，助教会给你一个装有10 只刚麻醉的幼虫的玻璃培养皿。在解剖镜下，用针固定幼虫使其腹面向上。首先，在其尾部插针固定，握住其头部或口器用力拉直幼虫，不要让它扭曲或翻转，然后在伪头后插针固定。

任务2b

利用与问题1 相同的解剖方法，这次腹面向上。解剖开后，小心地拨动肠道和马氏管，用针固定在一旁。同样可将脂肪移动至一旁或去除。拨动这些组织时，你需要小心地拨断一些微气管。背血管是沿着背中线走行的管（图1和图6）。在移除其他组织时，不要去除脑和太多的气管，不要直接或间接地用镊子碰触或损伤背血管。所有这些触碰或损坏都可能阻止“心脏”跳动。如果PBS 由于脂滴而浑浊，则使用1 000 μL 移液器和吸头小心吸出并更换PBS。

图6 红头丽蝇幼虫的腹面解剖图

任务2c

观察背血管，应该观察到2 条平行的线。如果背血管正在跳动，2 条线会在横向方向上向相反的方向脉动／移动，而后一起同步返回，这是一次心跳。当对你的准备满意时，请举起绿旗，助教将在这张表上签名，并确认：1）背血管已正确暴露；2）背血管完好无损，且能跳动。

如果背血管未被暴露，助教会向你出示红旗；如果背血管暴露出来，但不能跳动，助教向你出示红旗和绿旗；如果背血管成功暴露出来，且能跳动，助教会向你出示绿旗。

该部分解剖，你有10 次试验／尝试机会，一旦你已成功暴露一个条跳动的背血管，并已给助教展示过（他们将在考试纸上写一个特定的代码），你就可进入任务2d。

如果你的时间或幼虫用完，或不想再做进一步解剖，你必须在表格下方签名，才能跳至任务2d 结束考试，否则任务2d 将不会给分。

助教代码正确暴露出背血管但没有搏动（5 分）或正确暴露背血管且搏动（10 分）

如果助教已签字，且你想进入下一个任务，请在下面签字。

任务2d

观察：哺乳动物心率受到许多药剂的影响。神经递质例如乙酰胆碱可降低心跳强度（负离子性）和速率（负变时性）；相反，激素例如肾上腺素可增加心跳强度（正离子性）和速率（正变时性）。

假设：从这些观察结果可提出如下假设：假设H1，乙酰胆碱会降低红头丽蝇背血管每分钟跳动次数（bpm）；假设H2，肾上腺素会增加红头丽蝇背血管每分钟跳动次数（bpm）。在图7上绘制单线图，以显示使用药物A、B 和W（PBS 冲洗）的预期结果，实验是在单一幼虫样本上进行的。确保正确显示出背血管每分钟跳动次数（bpm）在实验时间中的变化。

图7 给红头丽蝇背血管添加乙酰胆碱（药物A）、肾上腺素（药物B）和PBS 冲洗液（W）的预期结果的线图（7 分）

1）你需要设计并完成实验检验假设H1 和H2，以揭示昆虫激素和章鱼胺（C）如何作用于在任务2b 中分离、任务2c 中确认的背血管。

2）下面的长条块表示你在单一幼虫样本上进行实验理想的持续时间。将该长条块分成几段，表示你分别使用的药物溶液（A、B 和C）和PBS 冲洗液（W）的顺序，实验对象是任务2c 中制备的一个幼虫样本。在每段中写入相应的字母，前2 步的字母已经为你填写了。

3）在设计实验时，你需要考虑并有效地指出组织的洗涤和重复等。

图8 实验设计：PBS 冲洗液和药物的添加计划（12 分）

任务2e

1）配制新鲜的PBS（W），记录每分钟心跳次数（bpm）的基准。

2）3 个eppendorf 管分别标有A、B 和C，里面有药物储存液：A=2×10-2mol／L 乙酰胆碱，B=2×10-2mol／L 肾上腺素，C=2×10-2mol／L 章鱼胺。医用方瓶中有100 mL PBS 溶液。临使用前，在1 mL eppendorf 管中将A、B 和C 溶液用PBS 稀释到工作浓度5×10-3mol／L。在表2中记录每种药物稀释时的体积（单位用μL）。

3）根据你理想的实验设计（图8），考虑剩余时间，评估药物A、B、C 和W 对单一解剖标本的影响。将静息状态背血管的平均每分钟跳动次数和药物A、B 和C 处理后的平均每分钟跳动次数的原始数据和平均数填入表2。

4）根据你的数据，选择表中bpm 对应的响应，例如增加、变化不超过10%或减少。

5）从你的数据说明每种药物的受体是否表现出活性，有活性记为1，无活性记为0，填在第4行的对应列中。

表2 静息状态的每分钟跳动次数，药物A、B 和C 的效应，以及药物的鉴定（12 分）

任务2f

1）根据你实验获得的随时间变化的原始数据，在所给的绘图纸上，画出一个合适的图。记住这将代表应用于单个实验的数据。

2）对于该实验，假设H1 是红头丽蝇背血管对乙酰胆碱的响应是负变时性，假设H2 是背血管对肾上腺素的响应是正变时性的，像哺乳动物的心脏一样。

3）你需要根据你的数据作出决定，接受或拒绝这些假设。

下面圈出你的决定（2 分）：

H1 接受 拒绝

H2 接受 拒绝