固定化酵母细胞实验的再探究

卢彦军 谭慧慧

（1 岳阳市教育科学技术研究院 湖南岳阳 414000 2 临湘市第一中学 湖南岳阳 414300）

高中生物学选修1 课题3 中“酵母细胞的固定化”实验在2019年新增为高考内容［1］，这对于一线学生和教师是一个新的挑战。高考考试说明要求学生能独立完成实验，掌握相关的实验操作技能，理解实验目的、原理和方法，并能将实验涉及的方法和技能等进行运用。借助这项实验能更好地发展学生的生物学学科核心素养，特别有助于提升科学思维和科学探究能力［2］。

酵母菌的固定化实验操作包括制备固定化酵母菌和用固定化酵母菌发酵2 个方面。可从2 个方面评价实验的成败，一是形成的凝胶珠颜色和形态；二是观察利用固定化酵母细胞发酵的葡萄糖溶液是否有气泡产生、产生气泡的速度及是否有酒味。笔者在观察学生做实验时，发现对学生而言该实验操作难度大，成功率低，明显影响学生的实验热情。鉴于此，笔者对该实验进行了再探究，从酵母细胞的活化条件、海藻酸钠的溶化条件和海藻酸钠的配制等实验疑难点入手，建立多组对照实验，反复探究，逐步优化，提高了实验的成功率，以下对再探究过程进行梳理，以期为学生实验或演示实验提供参考。

1 实验主要疑难点及原因分析

1.1 实验耗时长 按照本实验的实际情况需要安排2 课时，第1 课时完成本实验背景和基础知识的学习，第2 课时主要进行实验操作与评价。但往往第2 课时实验进程很紧，影响教学进度，有些操作很耗时，例如干酵母活化时间需1 h。

1.2 配制海藻酸钠溶液难达标 配制海藻酸钠溶液难达标，原因是：1）海藻酸钠为固体粉末，需加热促进其溶解，而在加热过程中稍不注意就会发生焦糊现象；2）海藻酸钠粉末在水中不易溶解、易结块，加热溶解后易粘到玻璃棒和烧杯壁上，使溶液不易定容至10 mL，而结块的海藻酸钠固定的酵母细胞数量少，结块部位凝胶颜色偏浅，且在制作凝胶珠时会形成不规则的尾巴。

1.3 凝胶珠容易含有气泡 海藻酸钠溶化后，溶液中存在许多小气泡；用海藻酸钠和酵母菌的混合液滴凝胶珠时，混合液中也很容易因搅拌产生气泡；这些气泡会随着混合液进入凝胶珠内，会使凝胶珠浮在液体表面，影响固定化细胞质量，影响后续发酵过程。

这些主要疑难点让学生在实际实验操作中很难跨越，造成实验成功率低，影响实验教学效果。

2 疑难问题解决思路及处理方法

2.1 优化实验条件，减少实验时间 设置活化时间梯度为15 min、30 min、45 min 和60 min；温度梯度为常温（室温20℃左右）、30℃和40℃；经过预实验多次探究，获得比较理想的方案是将高活性干酵母在35～40℃温水中活化，活化时间为15～20 min，极大降低活化时间。该过程原方案需要教师课前准备，在优化实验条件缩短活化时间后，可将该环节移入课堂，学生可直观认识酵母细胞活化中体积变化等过程。

2.2 探究海藻酸钠溶液配制的最佳实验方案 本实验的最关键步骤在于海藻酸钠溶液的配制，海藻酸钠的加热溶化、浓度控制等是实验的难点，影响实验成功的关键所在。为了获得最佳实验方案，笔者对该过程的2 个方面进行了反复探究［3］。

1）探究减少海藻酸钠加热溶化时结块和焦糊现象的条件。按照表1探究海藻酸钠溶液不同的配制方法，并进行比较。综合实验现象发现，先加海藻酸钠易焦糊，原因是先加入的海藻酸钠会粘连在烧杯底部，不及时搅拌或搅拌不充分，直接加热时会使底部海藻酸钠烧焦，学生在实际操作中极易发生此现象。常温水较沸水更易结块。方案4为最优方案，即采取先将沸水倒入烧杯中，再加海藻酸钠，边搅拌边加热，无焦糊现象且结块现象也明显减少。

表1 海藻酸钠溶液的配制方法比较

2）探究适宜的海藻酸钠溶液浓度配制方案。海藻酸钠溶液的配制方案的再探究实验过程如下［4］：首先进行预实验，海藻酸钠采用相同质量0.7 g,水的体积分别设置为10 mL、15 mL 和20 mL，结果确定凝胶珠成型的大概范围为10～15 mL；尽管15～20 mL 也得到圆球形凝胶珠，但因水量增加形成的凝胶珠颜色变浅，说明凝胶珠固定的酵母细胞数量少，所以将水的选取量范围确定为10～15 mL。然后，以1 mL 为梯度，将水的体积范围进一步细化为9～15 mL，设置7 个实验组，进行比较分析。实验探究过程及结果见表2和图1。结果表明，如果海藻酸钠浓度过高，很难形成凝胶珠；如果海藻酸钠浓度过低，形成的凝胶珠偏白色，凝胶珠所包埋的酵母细胞数目少，影响实验效果（该结论是由预实验的结果得出的）；由此得出结论，15 mL 水＋0.7 g 海藻酸钠与10 mL 的酵母细胞溶液配制成的混合溶液制成的凝胶珠效果最佳。

表2 海藻酸钠溶液浓度梯度与实验效果比较

图1 不同实验组凝胶珠照片

在多次实验和探究中，原方案0.7 g 海藻酸钠加入10 mL 水配制海藻酸钠溶液，与10 mL 的酵母细胞溶液配制成的混合溶液制作凝胶珠，其形状很难符合要求。而0.7 g 海藻酸钠加入15 mL水配制的海藻酸钠溶液，再与10 mL 的酵母细胞溶液配制成的混合溶液制成的凝胶珠为规则圆球状，成型效果最佳。

2.3 结合发酵效果再探究 经反复探究，对比能形成规则圆球形的几种新方案，其中最佳方案是0.7 g 海藻酸钠加入15 mL 水配制的海藻酸钠溶液，这与教材原方案有区别。为探究其在实际发酵中效果如何，笔者开展进一步实验，发现在对照实验中发酵效果优势不明显。教材中海藻酸钠溶液与酵母细胞溶液的体积比为1∶1，若用15 mL 加水量的海藻酸钠与10 mL 的酵母细胞混合，会使单位体积的凝胶中固定的酵母细胞少，所以在考虑加热过程中水分散失的情况下，将海藻酸钠溶液的加水量定为12 mL；但由于前面实验已确定12 mL 水加0.7 g 海藻酸钠无法得到凝胶珠，所以减少海藻酸钠的量进行实验。以0.1 g 为梯度递减，发现0.6 g 海藻酸钠加12 mL 水，最终制得的凝胶珠带小尾巴，故排除；而0.5 g 海藻酸钠加12 mL 水配制的海藻酸钠溶液，再与10 mL 的酵母细胞混合制得的凝胶珠是规则的圆球状、颜色淡黄且弹性好，所以选择0.5 g 海藻酸钠加12 mL水配制海藻酸钠溶液。

确定获得凝胶珠的最佳配置方案后，对其发酵效果做再探究实验。表3为3 种情况的实验探究情况，发酵时间分别为20 min 和40 min。固定化酵母细胞在酒精发酵时会产生二氧化碳，二氧化碳在凝胶珠中达到一定量后，凝胶珠会浮起，故以凝胶珠在发酵中上浮情况为指标，即单位时间内凝胶珠的浮起数量。图2所示锥形瓶从左至右分别为表3中甲、乙、丙3 组在发酵40 min 时的效果，实验现象显示丙组的发酵效果最佳。

表3 凝胶珠的发酵效果比较

图2 凝胶珠发酵40 min 效果

若以单位时间内产生气体的体积作为发酵效果衡量指标，理想设置应使用有刻度的水平玻璃管，通过有色液滴移动的情况精准定量。笔者在实际操作中使用同一规格的气球作为检测手段，进行粗略定量。图3、图4和图5分别为发酵0 min、120 min 和10 h 的实验效果，室温约为20℃。各图中从左至右的3 个锥形瓶分别与表3中的甲、乙、丙3 组对应。对比甲、乙、丙3 个组在相同时间段发酵产生气体的体积发现，丙组发酵效果最好，甲组发酵效果次之，乙组发酵效果最差，说明乙组凝胶珠固定的酵母细胞最少，丙组凝胶珠固定的酵母细胞最多，即0.5 g 海藻酸钠加12 mL 水，再与10 mL 酵母细胞溶液配置的凝胶珠形状颜色俱佳，且发酵效果最好。

图3 凝胶珠发酵0 min 效果

图4 凝胶珠发酵120 min 效果

图5 凝胶珠发酵10 h 效果

2.4 凝胶珠中易含气泡的处理 利用真空原理排出气体。除去混合液中的气泡也很关键，将海藻酸钠溶液和酵母细胞混合，进行充分搅拌，使其混合均匀，转移至注射器中；将注射器活塞缓缓推进，待混合物刚溢出针孔为止，用清洗过的食指按住针孔，并将活塞缓缓后退，待混合物中空气溢出后松开食指，推进活塞排出空气，如此反复数次，直至无空气再溢出为佳。这样获得的凝胶珠都会沉底，韧性好、有弹力。

3 小结

新的高中生物学课程标准要求教学高度关注生物学学科核心素养的达成［2］，积极引导和组织学生进行探究性学习，通过组织以探究为特点的主动学习落实生物学学科核心素养的发展。酵母细胞的固定化实验是高中生物学选修1 中一个极富有挑战性的实验，2019年新增加为高考内容，说明其适合学生完成。以该实验为素材又不拘泥于教材，根据学生操作的实际情况，带领学生一起再探究是一种体验式学习和创新的尝试，探究过程可能会出现一系列的新问题，却不会有相关提示，这就需要学生和教师不断进行预实验，再探究，反复分析摸索，此过程可让学生和教师都能有更多的收获。最终获得最佳实验方案，也有助于指导后续实验操作，顺利完成实验。