硫自养反硝化中亚硝酸盐积累的研究现状与展望

杨世东，刘 涵

(东北电力大学建筑工程学院，吉林 吉林 132012)

含氮废水被排入水体后，一方面会造成水体的富营养化现象使生态系统紊乱；另一方面还可以作为硝化细菌的能源，消耗水中溶解氧使水体缺氧[1].硝酸盐在缺氧条件下会被转化为亚硝酸盐，产生“三致”作用，危害人类健康.目前氮素废水的治理已成为公众关注的焦点[2].

废水脱氮技术主要包括物化法和生物法等.相对于运行费用较高的物化法，生物脱氮更为经济有效，被广泛应用在生产实践中.传统生物脱氮技术是以微生物硝化和反硝化作用为理论基础，并以此为发展出一系列新型生物脱氮工艺如厌氧氨氧化(Anaerobic Ammonia Oxidation，ANAMMOX)、短程硝化反硝化(Short-range Nitrification and Denitrification，SNAD)、同步硝化反硝化等(Simultaneous Nitrification and Denitrification，SND)[3].厌氧氨氧化工艺是以氨氮作为电子供体，以亚硝酸盐作为电子受体，在厌氧氨氧化菌的作用下反应生成氮气的一种高效、经济的脱氮工艺[4-7].水中亚硝酸盐的不稳定特性会影响厌氧氨氧化工艺的进行[8].经研究者发现某些化能自养反硝化细菌如脱氮硫杆菌(Thiobcillus Denitrificans)可以利用无机碳源进行反硝化反应产生NO2--N积累，为厌氧氨氧化反应提供充足的电子受体[9].

在硫的自养反硝化过程中，亚硝酸盐是反应的中间产物.但是在特定条件下由于亚硝酸盐转化速率受到限制，亚硝酸盐易成为最终产物[10-11].其中生成的亚硝酸盐作为电子受体参与厌氧氨氧化反应，使厌氧氨氧化与反硝化耦合[12-15].若以硫化物为底物的硫自养反硝化体系内同时存在 ANAMMOX 微生物和氨氮时，可以通过改变反应条件使硫自养反硝化反应至亚硝酸盐阶段停止，接着通过厌氧氨氧化反应去除水中含有的亚硝酸盐.该反应一方面可以将自养反硝化过程限定于生成亚硝酸盐阶段，减少硫化物的投加量、硫酸盐的产生量和碱度的消耗量，另一方面由于厌氧氨氧化反应本身会产生碱度，可以补充部分自养反硝化的耗碱量.由此可见，通过亚硝酸盐的积累来探究其对反硝化与厌氧氨氧化耦合过程脱氮性能的影响非常必要.

本文综述了硫自养反硝化的反应机理以及如何对影响亚硝酸盐积累的因素进行精准调控，探讨了厌氧氨氧化-自养反硝化技术的主要途径.

1 硫自养反硝化代谢过程

1.1 硫自养反硝化

反硝化作为废水处理中生物脱氮的核心，一直是废水生物脱氮技术的研究重点.由于异养反硝化具有较好的脱氮效果，作为污水处理过程的常用的传统工艺技术被广泛应用到污水处理中.异养反硝化较高的污泥产量会增加经济成本.自养反硝化由于其成本低、污泥差率低等优势，逐渐成为了研究热点[16].

硫自养反硝化技术(Sulfur Autotrophic Denitrification，SAD)指某些微生物在缺氧或厌氧条件下利用还原态硫为自养反硝化提供电子的技术，可以同时去除氮硫化合物，根据公式(1)、公式(2)、公式(3)[17].在地下水、市政污水、工业废水以及饮用水等含氮、硫的污染水体中，通过硫自养反硝化使硫元素和氮元素形态转化发生耦合作用，为污染水体的治理与修复提供参考.[18]

(1)

0.421H2S+0.421HS-+NO3-+0.086HCO3-+0.346CO2+0.086NH4+

(2)

(3)

在水体治理与修复过程中，硫自养反硝化菌因其独特的反硝化特性广泛应用于水体治理中.通过该菌将废水中硫化物转化为对环境影响较小的单质硫进行回收，硝酸盐氮还原为氮气去除的特性实现同步脱氮除硫，用于治理硝酸盐氮污染的地下水、生活污水生物脱氮.近年来其应用范围不断扩大，开始逐渐用于垃圾渗滤液、河岸渗滤液、闭合循环养殖系统废水等低碳/氮比的特殊污染水体[19].该过程典型的反应方程式，如公式(1)所示.由于硫自养反硝化与异养反硝化相比无需外加有机碳源，经自养反硝化处理后，出水具有细菌含量低、水质好的优点[20].

参与硫自养反硝化过程的细菌主要为Thiobacillus Denifications和Thiomicrospira Denitrificans[21].DO、pH、硫颗粒粒径、S/N比、NO3-浓度、营养物和HRT是影响单质硫型自养反硝化速率的主要因素[22].虽然单质硫的经济性使其可成为工业废水反硝化的替代电子供体，但对其反应机理和反应动力学还需进一步理解.开发和研究新的反应器提高脱氮效能，使实际应用成为可能.

1.2 代谢过程

微生物反硝化是通过消耗细胞外化合物(有机物、氢离子和硫化物等)所产生的电子将NO3--N转化为N2的主流异化途径[23].在生活、农业或工业生产污废水进行微生物脱氮治理过程中，以生成、传递和消耗等组成的电子传输系统对微生物的硫自养反硝化起关键作用.因此，研究微生物反硝化的代谢过程可以明确生物代谢机理.

图1 硫自养反硝化细菌的代谢过程

整个代谢过程主要发生在细胞周质内如图1所示.首先，NO3--N进入细胞周质内在硝酸盐还原酶(Nar)的催化下发生硝酸还原反应.由于硝酸盐还原酶具有两种基因表达形式：Nar 基因表达的膜结合硝酸盐还原酶和Nap 基因表达的周质硝酸盐还原酶[26].在厌氧条件下利用还原态硫化物作为电子供体参与硝酸盐的还原过程.其次NO2--N在亚硝酸盐还原酶(Nir)发生还原反应，在亚硝酸盐还原酶(Nir)主要存在于细胞周质中有两种非同源性的基因表达，即含铜的NirS 和含细胞色素的NirK.随后，NO几乎全部被位于细胞内膜上的一氧化氮还原酶(Nor)催化转化为N2O.最后，从细胞内膜释放或者环境中进入周质中的N2O被位于细胞周质内的一氧化二氮还原酶(Nos)还原成N2.

2 亚硝酸盐积累的产生以及与氨氧化耦合的可行性

2.1 亚硝酸盐积累的产生

在硫自养反硝化过程中，水中的硝酸盐与硫化物最终生成单质硫和氮气，其中亚硝酸盐是反应的中间产物，但通过控制一定的条件，亚硝酸盐的转化会受到抑制，使反应的终产物为亚硝酸盐，从而产生亚硝酸盐的积累现象[27].因此部分硫自养反硝化工艺可以代替异养反硝化工艺将硝酸盐转化为亚硝酸盐.此时，亚硝酸盐积累率达到70%左右[28].部分硫自养反硝化与短程硫自养反硝化构成硫自养反硝化.通过部分硫自养反硝化产生的亚硝酸盐通过ANAMMOX工艺去除.同时短程硫自养反硝化可以将ANAMMOX不能去除的硝酸盐还原，使进水的自由度提高[29].

2.2 与氨氧化耦合：累积的亚硝酸盐作为氨氧化的基质

硫自养反硝化与厌氧氨氧化耦合是通过控制一定条件，先利用硫自养反硝化细菌将硝酸盐控制在亚硝酸盐阶段，使亚硝酸盐为终产物，实现亚硝酸盐的积累，然后以积累的亚硝酸盐作为厌氧氨氧化的电子受体，将亚硝酸盐还原为氮气，从而实现同步脱氮除硫目的[30].同时硝酸盐与单质硫的反应需要一定的传质速率，可以通过强力搅拌的方式使中间产物亚硝酸盐更多的从固-液相界面传递到液相，产生亚硝酸盐积累，为厌氧氨氧化反应提供的底物支撑[9].

其中：r1硫自养反硝化反应(S(-II)→S(0))；r2 硫自养反硝化反应(S0)→S(VI))；r3亚硝酸盐氨氧化；r4 硫还原厌氧氨氧化 图2 自养反硝化与厌氧氨氧化协同作用下硫循环和N2产生途径的研究

2.3 硫酸盐还原氨氧化过程

在制药工业等含有高氨氮浓度、低C/N和硫污染物的废水中该途径可以实现同步脱氮除硫，处理高浓度氨氮废水如图2所示.氨氮可以进行硝化反应产生硝态氮作为反硝化的产物.然后硫化物和硝态氮进行硫自养反硝化反应(r1、r2)，一部分产生厌氧氨氧化(r3)的基质-亚硝态氮进行厌氧氨氧化反应，进一步去除水中氨氮.另一部分直接生成氮气和硫酸盐还原厌氧氨氧化(r4)的底物-硫酸盐，与氨氮进行硫酸盐型厌氧氨氧化生成氮气和硫化物.即实现硫元素在体系中循环，又提高了氨氮的去除效率.

3 硫自养反硝化代谢过程中亚硝酸盐积累的影响因素

3.1 初始S/N影响

当废水中同时含有氮硫化合物时，S2--S浓度过高会抑制厌氧氨氧过程(ANAMMOX)的活性[33].随着生物废水脱氮的进行，水体中的硫化物含量过高会造成细胞死亡进而使颗粒直径减小，使质量生长速率受到抑制.但是这种抑制不是绝对的.有研究表明，一种反硝化微生物可以以硫化物和硝态氮作为底物基质，并以较高的速率进行反应.此时尽管硫化物浓度仍处于较高状态，但不会对厌氧氨氧化菌的活性造成影响[34].

硫自养反硝化脱氮过程与异养反硝化过程的脱氮路径十分相似，如公式(1).当硫化物作为自养反硝化脱氮的电子供体时，自养反硝化污泥中除了4种氮还原酶以外，还存在大量硫化物氧化酶(Sulfide-quinone Reductase)[35].因此初始硫氮比率(S/N)起至关重要的作用.通过改变氮硫摩尔比使作为硝酸盐还原的中间体——亚硝酸盐产生积累，如下式.亚硝酸盐立即被数量相对较多的厌氧氨氧化微生物还原[36].

(4)

(5)

由于不同 S/N 摩尔比会导致反应产物不同，控制合理的 S/N 摩尔比是将硫化物型自养反硝化控制在半反硝化阶段的关键之一.相关研究者发现[37]：当S/N分别为1.5，2.5，3.5时，亚硝酸盐积累随着初始S/N的增加而增多.另外，由liu 等[38]根据S/N的不同，将该过程分为五个阶段(S/N由1∶3.42 分别减少至1∶2.28、1∶1.71、1∶1.14、1∶0.76)，在第一阶段时，亚硝酸盐积累率可以达到80%；在其余几个阶段，亚硝酸盐积累率逐渐降低.过量硝酸盐作为的电子受体产生了亚硝酸盐的积累，使80%的硝酸盐(NO3--N)转化为亚硝酸盐(NO2--N).Wang 等[39]发现当S/N在0.4～1.1时，产生大量亚硝酸盐积累.并通过实验研究了不同硫氮比对自养反硝化活性的影响.S/N比值分别为3.70 g/g和6.67 g/g，可能由于硝酸盐的比还原率高于亚硝酸盐，因此可以观察到亚硝酸盐瞬时累积的现象.当S/N比为1.16 g/g和2.44 g/g时，发生部分反硝化，使亚硝酸盐成为主要终产物[40].综上所述，S/N摩尔比会对亚硝酸盐积累造成显著影响，NO2--N积累率与初始S/N呈正相关.

3.2 水力停留时间(Hydraulic Retention Time，HRT)

水力停留时间(HRT)是指待处理污水在反应器内的平均停留时间，也就是污水与生物反应器内微生物作用的平均反应时间[41].水力停留时间(HRT)是厌氧生物反应器非常重要的工程控制参数.较短的水力停留时间有助于形成较高的有机负荷率(OLR)和较高的流速，促进生物质的生长[42].同时尤为重要的是过高的水力停留时间(HRT)也会造成反应器有效容积的浪费[43].

有研究发现，随着水力停留时间(HRT)的增大，反应器内各层的DO迅速下降，当出水DO降到0.5 mg/L或以下时，反应器开始出现反硝化效果，产生亚硝酸盐(NO2--N)的积累[44].对于硫自养反硝化过程，由于其为释能反应，若是 HRT 过短，该反应所产生的能量不能够满足细胞合成代谢的需要.HRT与硫自养反硝化过程中亚硝酸盐(NO2--N)的积累密切相关.有研究表明，在自养增强型漂浮处理湿地(Autotrophic Enhanced Floating Treatment Of Wetlands，AEFTW)(厌氧条件)、HRT缩短至0.5 d时，会产生最大的亚硝酸盐积累率[45].由此可见，HRT是硫自养反硝化中 NO2--N 的积累的一个重要影响因素[46].

Liu等[38]研究表明，在硫的自养反硝化与厌氧氨氧化耦合过程中，将HRT控制在在6 h～8 h，亚硝酸盐积累保持在70%左右.Qaisar等[47]在利用硫自养反硝化菌以亚硝态氮做电子受体时，缩短HRT使硫自养反硝化菌缺乏充分的反应时间，使NO2--N完全反硝化为N2，这样会造成部分 NO2--N 积累.蔡婧等[48]研究发现，硝酸盐(NO3--N)转化为N2所需的最短反应时间为5 h，而亚硝酸盐(NO2--N)转化为N2所需的最短反应时间为4 h.利用这一特性，控制HRT，将其缩短至硝酸盐转化为亚硝酸盐阶段，从而可维持稳定亚硝酸盐(NO2--N)积累.

3.3 pH

pH是水溶液最重要的理化参数之一.在发生硫自养反硝化的氮硫废水中，pH值的变化不但会对微生物的生长和代谢产生影响，还会产生多种效应.引起生物体表面电荷的变化，影响其对底物吸收的能力；导致微生物体内的酶活性的变化，影响细胞内发生的生物化学反应；改变硫化物的存在形式，影响底物的有效性和毒性[49].

硫的自养反硝化过程是产酸反应[50]，如公式(1)所示.对于硫自养反硝化反应其为分步反应，如公式(4)、公式(5)所示.硫的自养反硝化的第一步反应，见公式(4)可知在碱性条件下 NO2--N较易发生积累；第二步反应，见公式(5)表明在酸性条件中会消耗硫化物.因此，为实现增加NO2--N的积累量、减少硫化物消耗，最适pH应高于7.

Charles Glass等[51]研究发现反硝化菌具有较宽的适宜pH范围.在碱性条件下，亚硝酸盐还原酶的活性受到抑制，使亚硝酸盐反硝化速率衰减，从而导致亚硝酸盐(NO2--N)积累.Furumal 等[52]研究了pH和碱度对硫的自养反硝化的影响，发现pH 和碱度的改变会影响亚硝酸盐(NO2--N)积累.在碱性或中性环境中，pH会抑制亚硝酸盐的还原，从而影响亚硝酸盐(NO2--N)积累.当pH处于碱性条件下可以提高厌氧生物同步脱氮除硫工艺流程中亚硝酸盐(NO2--N)的积累效果.由此可见，当pH=7时，自养反硝化过程具有最高的亚硝酸盐(NO2--N)去除率.通过实验发现随着pH增加，会影响硝酸盐(NO3--N)和亚硝酸盐(NO2--N)还原酶的活性，使硝酸盐(NO3--N)转化速率迅速提高而亚硝酸盐(NO2--N)去除速率逐渐降低.在pH=8.5时，会发生亚硝酸盐(NO2--N)积累[53].由此可见，pH 会对硫化物型自养反硝化过程产生影响，碱性条件可以实现亚硝酸盐(NO2--N)积累现象[54].

3.4 微生物群落结构

硫的自养反硝化过程作为产酸过程，不需要额外有机碳源，并且会产生少量硫酸盐.此过程会导致系统pH的降低，使ANAMMOX 活性减弱，促进亚硝酸盐的积累.

反硝化脱硫菌大多数为变形菌门硫细菌属，可分为几种亚类群，其中包括：(1)严格化能自养型菌；(2)兼性自养菌；(3)巨大丝状菌[55-56].其中在严格化能自养型菌中的脱氮硫杆菌是目前研究最为透彻的反硝化脱硫菌.

在厌氧氨氧化耦合硫自养反硝化技术中，微生物利用硫化物氧化到S0同时将NO3--N还原为NO2--N 的速率要大于利用NH4+-N还原NO2--N到N2的速率，使NO2--N作为中间产物累积下来.目前厌氧氨氧化菌一共包括5个属，9个种[57].其中5个属为Candidatus‘ Brocadia’、Candidatus‘ Kuenenia’、Candidatus‘ Scalindua’、Candidatus ‘Jettenia’和Candidatus‘ Anammoxoglobus’.

通过采用单链构象多态性(SSCP)，变性梯度凝胶电泳(DGGE)和DNA测序技术[58-59]对微生物群落结构进行分析，发现在系统启动过程中主要以自养反硝化菌和厌氧氨氧化菌的形式存在，并且出现了Sulfurimonas 菌种，该类菌种是同步脱硫反硝化作用的主要功能菌，可以出现亚硝态氮积累现象.尽管在反应器不同时期的主要微生物群落为变形霉菌门和浮霉菌门，但所占比例不同.在系统稳定后，AnAOB和T.denitrificans活性随运行负荷增大而增加[60]，成为厌氧氨氧化耦合自养反硝化过程中的优势菌种.

根据不同时期微生物群落中菌种所占比例不同这一现象.如：AnAOB和T.denitrificans所占比例存在差异，使硫自养反硝化过程中产生亚硝酸盐(NO2--N)的速率大于厌氧氨氧化过程中亚硝酸盐(NO2--N)消耗，实现亚硝酸盐(NO2--N)积累现象的发生.因此，通过调节微生物群落结构的组成可以控制亚硝酸盐(NO2--N)的变化，是影响亚硝酸盐(NO2--N)积累的关键因素之一.

4 硫元素自养反硝化和厌氧氨氧化耦合的模型分析

在生物脱氮技术中，由于电子受体亚硝态氮的不足和反应产生的硝态氮排放的问题，使厌氧氨氧化(ANAMMOX)反应受到抑制[61].硫的自养反硝化可以将氨氮(NH4+-N)预氧化成硝态氮(NO3--N)，紧接着以硫化物为基质将硝态氮(NO3--N)转化为亚硝态氮(NO2--N)[36]，产生大量亚硝酸盐积累.由于同时涉及自养反硝化和厌氧氨氧化(ANAMMOX)的脱氮除硫过程很复杂，很难建立一个详尽的机理模型[62-63].由于该过程的影响因素多，欲实现对过程的精确描述和调控势必困难.

人工神经模型(Artificial Neural Networks，ANN)由于其是一种多层结构的前馈网络，只由输入层、输出层、隐藏层三部分构成，无需构建详尽的模型.通过调整内部大量节点之间相互连接的关系，从而达到处理信息的目的.由于其具有自主学习和自主适应的能力，人工神经网络在预测非线性问题上具有显著优势[64].

在水环境中，微生物受物理、化学和水力学等影响，其行为具有较明显的非线性特征.近年来，人工神经网络被广泛用于预测生物治理在各种应用中的性能，如处理富硫酸盐废水和堆生物浸出液[65].有研究表明，可以利用人工神经网络模型(ANN)对于硫化物对于亚硝酸盐(NO2--N)积累以及与厌氧氨氧化的耦合情况进行预测[66].Ramita等[62]通过实验验证和人工神经网络(ANN)预测了硝酸盐的去除率.利用人工神经网络(ANN)的绝对灵敏度(ASS)和平均灵敏度(AS)进行分析.当ASS=0.36时，硝酸盐(NO3--N)的去除率和亚硝酸盐(NO2--N)积累率最高.Wang等[67]采用人工神经网络(ANN)建立同步脱氮除硫的DSR(Denitrifying Sulfide Removal)动力学模型，并引入抑制函数.当硫化物浓度过高时，会对反硝化过程产生抑制，从而发生亚硝酸盐积累现象.因此尽管人工神经网络模型(ANN)的本质是数据拟合，无法体现输出与影响因素之间的关系，缺乏对硫自养反硝化过程中亚硝酸盐积累机理的解释.但是由于其预测结果更符合实际情况.人工神经网络模型(ANN)对于评价硫自养反硝化过程中亚硝酸盐积累是有效的.

5 结语与展望

如何解决厌氧氨氧化过程中亚硝酸盐的来源问题是目前研究的一大热点，由于硫自养反硝化技术具有效率高、能耗低等特点，得到了广泛的关注和研究.与传统反硝化相比，该工艺更适宜处理低C/N的废水.本文从不同角度(S/N、HRT、pH和微生物群落结构等因素)探究产生亚硝酸盐积累的影响因素.利用人工神经网络系统(ANN)进一步预测硫自养反硝化与厌氧氨氧化耦合过程中在实际情形中亚硝酸盐积累的现象.因此硫自养反硝化耦合厌氧氨氧化技术由于其同步脱氮除硫和回收资源等优点将成为主流利用硫自养反硝化的工艺.

以硫化物为电子供体存在毒害微生物的可能性，但是使其与厌氧氨氧化发生耦合的工艺可以增加微生物对硝酸盐的耐受能力、提高工艺运行性能，因此具有广阔的应用前景.以硫化物为基质的硫自养反硝化技术中，控制反硝化过程中生成NO2--N为厌氧氨氧化过程提供底物，是该工艺的关键所在.若要硫自养反硝化耦合厌氧氨氧化工艺得到更广泛的应用，需解决3点问题：(1)NO2--N积累的条件探究，需要对其控制条件进行进一步明确；(2)不同微生物代谢条件苛刻，导致较难生成单质硫以及很难发生多反应的耦合，因此需要对其影响因素进行精准调控；(3)产生的单质硫还不能完全回收，需要开发出一种新的回收方法.当这些缺陷完善后，硫自养反硝化技术将会在污废水处理领域解决脱氮除硫上发挥更大的作用.