MiR-4262经Kaiso-β-catenin途径抑制宫颈癌Hela细胞的增殖

(沧州市中心医院妇一科，河北 沧州 061000)

宫颈癌是是临床上最常见的妇科恶性肿瘤之一，其发病率有年轻化的趋势[1-2]。虽然通过早期筛查和治疗，宫颈癌的发病率有逐年降低的趋势，但其仍然是临床导致死亡的主要肿瘤[3]。微小RNA(microRNAs，miRNA)是一类由18～24个单核苷酸所组成的非编码的RNA，对基因的表达起着关键的调控作用，而miR-4262是最常见的miRNA之一，其水平与多种恶性肿瘤的发病及治疗密切相关。miR-4262在多种肿瘤中被鉴定为肿瘤启动子，而低水平的miR-4262预示着肿瘤患者预后较差，miR-4262可以靶向原癌基因cd163抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭[4-5]。Kaiso是BTB/POZ蛋白家族的成员，可以通过形成抑制复合物对目标基因表达等环节进行抑制，且对Wnt信号通路有正性调节作用[6]。β-catenin是Wnt信号通路的关键分子，与肿瘤细胞的增殖、分化、转移和凋亡等过程密切相关[7]。本研究分析miR-4262抑制宫颈癌细胞增殖的Kaiso-β-catenin机制，为临床治疗及药物研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞及分组

宫颈癌Hela细胞株购自中科院上海细胞所；培养基及太牛血清均购自Hyclone公司；pGL3-miR-4262表达载体由本实验室构建并保存。Bax/Bcl2及Caspase3一抗购自Santa Cruz公司；Kaiso一抗购自R&D公司；β-catenin及Axin一抗购自CST公司。将miR-4262表达载体pGL3-miR-4262表达载体瞬时转染Hela宫颈癌细胞株作为miR-4262组，以未转染Hela细胞和转染pGL3空载体细胞分别作为空白组和阴性组。分析各组细胞处理24 h及48 h后细胞增殖的抑制情况，分析细胞处理48 h后相关蛋白的表达情况。

1.2 MTT法

miR-4262pGL3载体构建过程：扩增引物为正向5′-TGCGGGACATTCAGA-3′，反向5′-GGAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′，步骤为扩增miR-4262序列-连接pMD 18-T转化后筛选阳性克隆-PCR扩增特异性片段并测序确认-PCR扩增酶切连接pGL3载体。转化筛选阳性克隆测序确认。将miR-4262表达载体pGL3-miR-4262表达载体瞬时转染Hela宫颈癌细胞株作为miR-4262组，前期预实验已表明4 μg左右的质粒量具有明显的效果，正式试验转染的质粒的量为4 μg。以未转染Hela细胞和转染pGL3空载体细胞分别作为空白组和阴性组。分别于处理后的第24 h及48 h轻轻弃去各组细胞培养孔内的培养液，加入200 μL的MTT继续于37 ℃、5%二氧化碳培养箱条件下培养。无菌磷酸盐缓冲液冲洗后在各组细胞中加入二甲基亚砜，震荡处理。用酶标仪检测培养后细胞培养板各个培养孔的吸光度值，并计算抑制率。细胞的增殖抑制率=(对照组OD值-试验组OD值)/对照组OD值×100%。

1.3 Western Blotting法

各组细胞处理后提取细胞的总蛋白并进行定量。以等量总蛋白上样后进行十二烷基苯磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，溴酚蓝电泳至凝胶底部时停止电泳。电泳结束后小心取下凝胶并进行半干法PVDF转膜(300 mA，45 min)。转膜后用无菌磷酸盐缓冲液冲洗。5%的胎牛血清进行膜封闭10 min。室温条件下将PVDF膜与第一抗体(400×)孵育60 min，无菌PBS冲洗(5 min×3次)后，与二抗(800×)孵育60 min。PBS冲洗3次后显色，拍照。以β-actin为内参进行蛋白表达的相对定量分析。

1.4 统计分析

数据统计采用SPSS 21.0统计软件完成，计量资料用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，总体比较有差异再采用LST-t检验进行两两比较，计数资料采用百分比表示，组间比较采用卡方检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-4262抑制宫颈癌细胞增殖效果分析

与空白组和阴性组相比，miR-4262组细胞的抑制率明显升高(P<0.05)，见图1。

图1 miR-4262抑制宫颈癌细胞增殖效果分析与对照组比较，*P<0.05；与阴性组比较，#P<0.05

2.2 各组细胞中细胞凋亡蛋白的表达

与空白组和阴性组比较，miR-4262组细胞的Bax和Caspase3表达明显升高而Bcl2表达明显降低(P<0.05)，见图2、表1。

图2 各组细胞中细胞凋亡蛋白的表达分析

2.3 各组细胞中Kaiso、β-catenin及Axin蛋白的表达

与空白组和阴性组比较，miR-4262组细胞的Kaiso、β-catenin表达明显升高而Axin表达明显降低(P<0.05)，见图3、表2。

表1 各组细胞中细胞凋亡蛋白的表达分析

与对照组比较，aP<0.05；与阴性组比较，bP<0.05

图3 各组细胞中Kaiso、β-catenin及Axin蛋白的表达分析

表2 各组细胞中Kaiso、β-catenin及Axin蛋白的表达分析

与对照组比较，aP<0.05；与阴性组比较，bP<0.05

3 讨 论

宫颈癌是妇科临床最常见的恶性肿瘤，也是导致死亡的最常见恶性肿瘤之一。微小RNA在多种恶性肿瘤的发生、发展及恶化过程密切相关，且与药物的治疗效果密切联系。miR-4262为肿瘤发生的启动子，且证据显示胃癌患者的胃组织中的miR-4262明显下调，在晚期胃癌中，MIR-4262的水平显著降低。较低水平的miR-4262可预测胃癌患者预后较差，而miR-4262可靶向原癌基因CD163，抑制胃癌细胞增殖和侵袭[8]。micrornas(mirs)水平和功能的改变与致癌有关。在分析miR-4262在人类皮肤恶性黑色素瘤(CMM)细胞增殖中的作用和潜在机制中发现KLF6在CMM细胞中起着肿瘤增强因子的作用，而MIR-4262通过KLF6介导的EGFR失活和p21上调促进CMM细胞的增殖[9]。在研究miR-4262对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制时也证实异常表达的miR-4262可能通过galnt4影响人结肠癌细胞的凋亡和增殖，这似乎是一个有希望的结肠癌治疗靶点[10]。本研究在分析miR-4262抑制宫颈癌细胞增殖的Kaiso-β-catenin机制时发现miR-4262组细胞的抑制率明显升高，Bax和Caspase3表达明显升高而Bcl2表达明显降低，且Kaiso、β-catenin表达明显升高而Axin表达明显降低，miR-4262能明显抑制宫颈癌细胞的增殖，且其作用可能与调节Kaiso-β-catenin信号通路蛋白表达有关。

Kaiso蛋白为Wnt信号转导通路的调节蛋白，其水平的异常与恶性肿瘤细胞的增殖、分化、转移及凋亡过程密切相关。Kaiso和p120ctn在胃癌中的表达呈负相关，二者可能共同参与胃癌的发生及分化，且Kaiso通过调控连环蛋白P120ctn及参与Wnt信号通路的激活调控相关基因的表达，进而影响肿瘤增殖、侵袭和转移[11]。异常的经典的Wnt信号通路的激活可以促进肿瘤的发生，P120连环蛋白/转录抑制因子Kaiso对Wnt信号通路的靶基因具有调控作用，影响Wnt信号通路从而影响肿瘤发生的过程[12]。本研究也发现miR-4262组细胞的抑制率明显升高，Kaiso表达明显升高且细胞凋亡明显，miR-4262能明显抑制宫颈癌细胞的增殖可能与调节Kaiso蛋白表达有关。Wnt/β-catenin信号通路也是药物干预治疗恶性肿瘤的重要靶点[13-14]。RACK1和β-catenin蛋白异常表达可能与子宫颈癌的发生、发展和预后有关，并影响子宫颈癌的淋巴结转移[15]，抑制宫颈癌细胞STIM1基因表达可通过下调Wnt/β-catenin信号通路降低癌细胞的增殖及侵袭能力[16]。β-Catenin在ESCC不同分化组间的表达存在水平差异，可为ESCC的预后评估提供参考[17]，TRPM3可能通过激活Wnt/β-catenin通路促进卵巢癌细胞的上皮间质转化过程，进而增强其侵袭转移的能力[18]。

因此，miR-4262能明显抑制宫颈癌细胞的增殖，且其作用可能与调节Kaiso-β-catenin信号通路蛋白表达有关。但本文仅观察了24 h及48 h肿瘤细胞的增殖情况，且发现48 h时各组细胞的抑制率差异显著，故未再延长观察时间，今后的研究有待进一步延长观察时间进行实验。同时，在以后的研究中将对体内不同临床分期及类型的宫颈癌样本进行病理学和免疫组织化学分析，分析Kaiso-β-catenin信号转导通路在细胞内的定位及表达，为临床更合理的诊断及治疗提供参考。