肉桂醛-羟丙基（β）环糊精包合物的处方工艺研究

孔云，刘黎瑶,，通信作者，熊倩，王庆奎

（天津农学院 a.基础科学学院，b.天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384）

肉桂醛是中药肉桂挥发油中的单体活性成分，化学名称为3-苯基丙烯醛，可通过水蒸气蒸馏，然后精馏分离提纯得到，也可通过以苯甲醛和乙醛为原料合成得到[1]。研究表明，肉桂醛具有显著的消化系统保护作用、抑菌、降血糖以及抗肿瘤等作用[2-3]。在畜牧养殖方面，肉桂醛作为饲料添加剂，能够提高氮素在动物体内的贮留量[4]。但肉桂醛分子中的醛基结构使其极易被氧化，导致化学性质极不稳定。同时，由于肉桂醛水溶性极差，导致其在药物递送过程中面临着生物利用度低、制剂成型性差等问题[5]。因此，有必要通过适宜的制剂学手段，对肉桂醛分子进行载体包覆，隔绝其与空气中氧气的接触，增加其化学稳定性，同时，改善其制剂成型性，使其更易于实际应用。

环糊精包合技术是一种有效增加中药挥发油稳定性的制剂技术，通过利用环糊精分子“内疏水性，外亲水性”的环状中空结构，将适宜形状和分子量的疏水性分子（客体）包载入内部疏水性孔穴，形成环糊精包合物，在增加被包合物质稳定性的同时，提高其水溶性以及制剂成型性[6]。目前已在多项研究中使用该项技术将肉桂醛制备成（β）环糊精包合物[7-8]，但由于 β-环糊精在水中的溶解度有限，并且具有一定的溶血性和刺激性，因此，将肉桂醛制备成（β）环糊精包合物并非最佳解决方法。

羟丙基（β）环糊精作为（β）环糊精的衍生物，极大程度上提高了水溶性，降低了溶血性及刺激性，是近年来发展较快的一种稳定、安全、有效的包合物材料[9-10]。因此，根据已有的研究基础[7-9]，本研究中使用超声-溶剂挥发法，在适宜的溶剂系统中，通过单因素试验以及正交设计，以羟丙基（β）环糊精对肉桂醛的包合率为筛选指标，对制备肉桂醛-羟丙基（β）环糊精包合物的处方工艺进行系统的筛选，以期在极短的包合时间内获得包合率较高的环糊精包合物。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

电子天平（Sartorius，BSA 223S）；旋转蒸发仪（Rotavapor R-100，BUCHI）；超声波清洗仪（昆山禾创仪器有限公司，KH5200B型）；紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；微孔滤膜等。

1.2 试药

肉桂醛（上海润捷化学试剂有限公司，反式，纯度98%）；肉桂醛标准品（中国药品生物制品检定院，HPLC≥99%）；2-羟丙基（β）环糊精（上海阿拉丁化学试剂有限公司，纯度90%）；无水乙醇、正己烷、甲醇、四氢呋喃、二氯甲烷（天津市风船化学试剂有限公司，分析纯）；所使用的其他试剂均为分析纯。

2 试验方法

2.1 肉桂醛-羟丙基（β）环糊精包合物制备方法

分别称取适量肉桂醛与羟丙基（β）环糊精置于烧杯中，加入适宜溶剂分别溶解之后，混合并振摇均匀，封口。置于超声波条件下进行包合反应。包合结束之后，减压蒸发多余溶剂，即得干燥的白色粉末状固体肉桂醛-羟丙基（β）环糊精包合物。

2.2 肉桂醛-羟丙基（β）环糊精包合物包合率测定方法建立

2.2.1 紫外-可见光区全波长扫描

称取肉桂醛标准品10 mg置于容量瓶中，加入无水乙醇超声溶解并稀释至适当质量浓度，用紫外-可见分光光度计测定其在200～900 nm波长区域内的紫外-可见光吸收情况，并绘制该区域内的扫描光谱图。根据全波长扫描光谱图选择含量测定的最适波长。

2.2.2 标准曲线绘制

准确称量肉桂醛标准品25 mg置于容量瓶中，加入无水乙醇超声溶解并定容至25 mL，配制得到质量浓度为1 000 μg/mL的储备液。精密量取适量储备液，并用无水乙醇稀释，得到200、400、600、800、1 000 μg/mL梯度质量浓度的标准溶液。通过紫外分光光度法，在最适吸收波长条件下，测定上述系列标准溶液的吸光度。以质量浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，并通过最小二乘法拟合出线性回归方程。

2.2.3 精密度测定

取2.2.2部分的低、中、高质量浓度的线性样品连续测定5次，测定其在最适波长下的吸光度，记录吸光度数值并计算相对标准偏差（RSD%）。

2.2.4 包合率的测定方法

利用肉桂醛-羟丙基（β）环糊精包合物中肉桂醛不溶于四氢呋喃而游离肉桂醛易溶于四氢呋喃的特性，在样品制备结束之后，加入适量四氢呋喃清洗游离以及吸附在包材表面的肉桂醛，减压蒸发去除残余的四氢呋喃，取适量样品，用无水乙醇溶解并稀释适宜倍数，于最适吸收波长条件下，测定包合物中肉桂醛的吸光度，采用标准曲线的回归方程，计算包合物中肉桂醛的含量。根据初始投料量（W0）与包合物中肉桂醛的质量（Wt）计算包合率（CE），计算公式为：CE（%）＝Wt/W0×100%。

2.3 单因素影响试验

2.3.1 反应溶剂筛选

根据文献调研[9]和前期试验结果，在本研究中，首先对包合反应的溶剂系统进行筛选。设定肉桂醛与羟丙基（β）环糊精的投料比为1∶10（质量比例），包合时间为30 min。以包合率为评价指标，对甲醇、无水乙醇、蒸馏水、甲醇-乙醇溶剂系统进行考察，以筛选出最佳的包合溶剂。

2.3.2 投料比例筛选

使用选定的包合溶剂，包合反应时间为30 min，以肉桂醛-羟丙基（β）环糊精包合物的包合率为评价指标，设定肉桂醛与羟丙基（β）环糊精的投料比为 1∶6、1∶10、1∶12、1∶15、1∶20（质量比例），对肉桂醛与羟丙基（β）环糊精的投料比例进行筛选。

2.3.3 超声反应时间筛选

使用选定的包合溶剂，并在选定的投料比例下，以肉桂醛-羟丙基（β）环糊精包合物的包合率为评价指标，设定包合时间分别为5、15、30、60、90 min，对包合时间进行筛选。

2.3.4 投料质量浓度比例筛选

选定包合溶剂之后，对投料质量浓度进行筛选，在筛选过程中保持上述选定的投料比例与包合时间，设定肉桂醛与羟丙基（β）环糊精的质量浓度比为 1∶5、1∶8、1∶10、1∶15、1∶20，以包合率为评价指标，筛选出最佳的投料质量浓度比例。

2.4 正交设计试验

根据单因素试验结果，在选定的最佳溶剂中，肉桂醛与羟丙基（β）环糊精的包合率受肉桂醛与羟丙基（β）环糊精的投料比例（A）、超声包合时间（B）以及投料质量浓度比例（C）的影响。因此，对上述因素进行三因素三水平的正交试验，以包合率为指标筛选出最佳的处方工艺。因素水平表如表1所示。

表1 正交设计因素水平表

2.5 优选处方下包合物的放置稳定性试验

在优选的处方工艺下，制备3批肉桂醛-羟丙基（β）环糊精包合物，分别测定其包合率，并于4 ℃条件下密封放置0、1、2、3个月，对该优选处方下包含物的放置稳定性进行评价。

3 结果与分析

3.1 肉桂醛含量的测定方法

3.1.1 全波长扫描

按照既定试验方法，使用紫外-可见分光光度计测定肉桂醛溶液在200～900 nm波长区域内的紫外-可见光吸收情况，并绘制该区域内的扫描光谱图，如图1所示。根据全波长扫描光谱图可知，测定肉桂醛含量的最适波长为291 nm。

图1 肉桂醛溶液全波长扫描光谱图

3.1.2 标准曲线的绘制

按照既定的试验方法，配制不同质量浓度肉桂醛标准品系列溶液，使用紫外分光光度法测定其在291 nm波长处的吸光度。结果表明：以吸光度（纵坐标，y）对浓度c（μg/mL，横坐标，x）进行线性回归，拟合得出的回归方程为y＝0.000 8x＋ 0.006 8（R2＝ 0.998 91），肉桂醛标准品系列溶液在0～15 μg/mL的质量浓度范围内线性关系良好，如图2所示。

图2 肉桂醛标准品系列溶液标准曲线

3.1.3 精密度测定

按照既定的试验方法，低、中、高质量浓度肉桂醛标准品溶液的精密度测定结果如表2所示。

表2 精密度试验结果

测定结果表明：对低、中、高质量浓度对照品溶液分别连续重复 5次测定的RSD值均小于2%，表明该测定方法精密度良好。

3.2 单因素影响试验

3.2.1 反应溶剂筛选

根据既定试验方法，以肉桂醛-羟丙基（β）环糊精包合物的包合率为评价指标，对甲醇、无水乙醇、蒸馏水、甲醇-乙醇溶剂系统进行考察，以筛选出最佳的反应溶剂，筛选结果如图3所示。

图3 包合溶剂筛选结果

分析结果表明，使用甲醇作为溶剂系统制备肉桂醛-羟丙基（β）环糊精包合物时，包合率均高于其他几种溶剂。因此，选择甲醇作为包合反应溶剂。

3.2.2 投料比例筛选

根据既定试验方法，在筛选过程中以甲醇作为包合溶剂，并保持超声包合时间为30 min。以包合率为评价指标，筛选出肉桂醛与羟丙基（β）环糊精的最佳投料比例（质量比例），筛选结果如图4所示。

图4 投料比例（质量比例）的单因素筛选结果

分析结果表明，当肉桂醛与羟丙基（β）环糊精投料比例从1∶6升至1∶15时，包合率逐渐升高，随后即有所下降。当二者的投料比例为1∶15时，包合率达到最大，为92.32%。

3.2.3 超声反应时间筛选

使用选定的包合溶剂，保持肉桂醛与羟丙基（β）环糊精的投料比例为 1∶15，以肉桂醛-羟丙基（β）环糊精包合物的包合率为评价指标，设定包合时间分别为5、15、30、60、90 min，对包合时间进行筛选，如图5所示。

图5 超声反应时间的单因素筛选结果

分析结果表明，在既定的条件下，包合反应在5～15 min之内即达到平衡，表现为包合率基本相当，并且均高于其他条件。之后，随着超声时间增加，未见包合率进一步显著增加。

3.2.4 投料质量浓度比例筛选

按照既定试验方法，以甲醇作为包合溶剂，设定肉桂醛与羟丙基（β）环糊精的投料比例为1∶15，并保持超声包合时间为15 min，设定待包合的肉桂醛溶液与羟丙基（β）环糊精溶液的质量浓度比例为 1∶5、1∶8、1∶10、1∶15、1∶20，以包合率为评价指标，筛选出最佳的投料质量浓度比例。筛选结果如图6所示。

图6 投料质量浓度比例的单因素筛选结果

分析结果表明，当肉桂醛溶液与羟丙基（β）环糊精溶液的质量浓度比为（1∶5）～（1∶8）时，包合率达到最高，为 95%左右，之后，随着羟丙基（β）环糊精溶液质量浓度的升高，包合率出现降低的趋势。

3.3 正交设计试验

通过三因素三水平（L9，34）正交设计，以包合率作为评价指标，对肉桂醛与羟丙基（β）环糊精的投料比例（A）、超声包合时间（B）和投料质量浓度比例（C）进行了正交筛选，得出制备肉桂醛-羟丙基（β）环糊精包合物的最佳处方，正交分析结果如表3所示。

表3 处方筛选的正交试验结果

分析结果表明，在影响肉桂醛-羟丙基（β）环糊精包合物包合率的三大因素中，肉桂醛溶液与羟丙基（β）环糊精溶液的质量浓度比例对包合率的影响最大，其次是投料比例与包合时间。通过正交分析得出最优处方为 A2B2C2，即肉桂醛与羟丙基（β）环糊精的质量比例为1∶15、包合时间为15 min、肉桂醛溶液与羟丙基（β）环糊精溶液的质量浓度比例为1∶8。

3.4 优选处方下肉桂醛-羟丙基（β）环糊精包合物的稳定性评价

按照最优处方条件制备了 3批肉桂醛-羟丙基（β）环糊精包合物，并对其放置稳定性进行初步评价，结果如表4所示。由表4可知，所制备的3批肉桂醛-羟丙基（β）环糊精包合物的包合率为（92.9±0.33）%，外观呈白色干燥粉末状。将上述3批包合物置于4 ℃条件下进行放置稳定性评价，结果表明，优选处方下肉桂醛-羟丙基（β）环糊精包合物放置3个月以内的稳定性良好，包合率以及肉桂醛含量均未发生显著变化。

表4 肉桂醛-羟丙基（β）环糊精包合物的放置稳定性评价（4 ℃）

4 讨论

根据形成机制，羟丙基（β）环糊精包合物是以羟丙基（β）环糊精作为分散载体（分散介质），通过适宜的方法制备的一类固体分散体，其中活性药物以无定形的状态均匀分散在分散载体中，能够显著改善难溶性药物的溶解性、溶解速度以及生物利用度[11]。根据药物的性质，可以通过多种方法来制备羟丙基（β）环糊精包合物，包括冷冻干燥法、熔融法等[12-13]。本研究通过筛选适宜的包合溶剂系统以及适宜的工艺条件，首次制备成功肉桂醛-羟丙基（β）环糊精包合物，有望为其进一步应用提供理论基础，具有很大的发展空间以及实际应用价值。

在研究中，通过单因素筛选发现，当肉桂醛溶液与羟丙基（β）环糊精溶液的质量浓度比为1∶5时，包合率达到最大，随着羟丙基（β）环糊精溶液质量浓度的升高，包合率逐步降低，当二者的质量浓度比例为 1∶20时，所测得的包合率仅为27.4%。提示使用溶剂挥发法制备环糊精包合物时，应当尽量降低载体材料质量浓度，使得主客体分子在稀溶液的条件下进行包合反应，有利于提高包合率。

同时，在试验过程中还发现肉桂醛与羟丙基（β）环糊精的质量浓度比例对于包合率也有较大影响。在最优处方条件下，上述二者的质量浓度比例为1∶15，换算成摩尔比例时大约为1∶1.3。从理论上来看，一个羟丙基（β）环糊精分子的空穴内仅能容纳一个客体分子[14-15]，这与本试验结果基本一致。略微增大载体材料的质量，能够在一定程度上提高包合率，但由于羟丙基（β）环糊精属于高分子物质，如果无限制增加其用量，则会大幅度降低包合物中肉桂醛的载药量。另外，在制备过程中发现，如果使用蒸馏水等含水溶剂时，大量的肉桂醛会漂浮在液面上，无法与羟丙基（β）环糊精溶液进行包合，导致肉桂醛-羟丙基（β）环糊精包合物基本不能包合成型。这可能是由于肉桂醛无法溶于水中形成均一溶液，导致其无法以分子状态与羟丙基（β）环糊精分子发生包合作用。因此，在后续的研究中，有必要针对难溶性药物的溶解状态与包合率的关系进行相关研究。