IL-8及SPB蛋白在兔海水及淡水淹溺型急性肺损伤模型中的表达

乔永平 刘轶宁

淹溺型急性肺损伤指因海水或淡水淹溺，液体经口鼻进入肺泡组织，导致广泛肺组织水肿，肺通气量短时间内下降，导致机体出现呼吸功能障碍，严重患者可在短时内脑死亡[1-2]。海水，淡水因溶质成分、理化性质差异，引起急性肺损伤的机制通路有所不同，但两者进入肺组织后除直接损失作用外，均引发肺组织广泛炎症因子分泌增多，炎症反应发生，同时可致低氧血症，酸中毒等并发症发生，故临床认为淹溺型急性肺损伤患者损伤机制与炎症发生有直接关联[3-4]。IL-8属于细胞白介素家族成员，是一种细胞炎症因子，通常由干扰素α(TNF-α)调节其分泌激活过程，其具有促进白细胞趋化，粘附的作用，是炎症反应启动的重要因子[5]。冯继峰等人在研究中证实其在机械性急性肺损伤中分泌可增加，对肺组织炎症发生有直接关联[6]。SPB是一种属于表面活性蛋白家族，是肺表面活性成分的主要组成部分，具有稳定肺泡膜表面磷脂单分子层的作用，能有效降低表面张力维持肺泡结构稳定；部分研究还认为SPB能在低氧情况下保护肺组织[7-8]。研究认为急性肺损伤发生过程中，因肺水肿、肺广泛炎症反应作用，肺泡磷脂単分子层受到破坏，炎症反应可影响SPB分子活性加重肺损伤[9]。本研究拟探究IL-8与SPB蛋白在淹溺型肺损伤中的表达情况，试探究其在淹溺型肺损伤中的表达意义。

资料与方法

一、一般资料

取由大连医科大学动物实验中心饲养健康成年新西兰兔36只，采用随机数表分组，将其分海水组，淡水组与对照组，各组实验兔为雌、雄各6只。三组兔均在SPF级动物房饲养一周后行麻醉下气管插管，气管插管完成后，海水组兔经气管插管向气管内注射3 mL/kg配置海水，淡水组经气管插管向气管内注射18 mL/kg配置淡水，对照组兔仅行麻醉气管插管操作。手术操作完成后，持续插管通气4h，通气结束后处死各组实验兔，收集肺组织。三组实验兔体重，年龄等一般资料数据差异无统计学意义，P>0.05(见表1)。本研究已经动物实验伦理委员会审核并通过。

表1 三组实验兔基线指标对比

二、干预方法

取于动物实验中心养殖健康成年新西兰兔36只，采用随机数表分组，将其分海水组，淡水组与对照组。选择入组后均在SPF级动物饲养房中饲养一周，于手术前一天禁食禁水。手术过程：取实验兔，耳缘静脉完成静脉置管后，予戊巴比妥钠30 mg/kg缓慢推注，待动物疼痛反射消失后取其置于操作架上，经口插入气管导管，调整呼吸机参数维持呼吸频率20～30次/分。取购置于第三海洋研究所，按我国东部沿海地区海水成分配置的人工海水，以3 mL/kg标准经气管导管注入海水组实验兔肺内；取取自本地符合水质三级标准淡水，以18 mL/kg标准经气管导管注入淡水组实验兔肺内。对照组实验兔仅行麻醉插管操作。完成操作后于耳缘静脉注射50 mL空气，处死实验兔。

三、观察指标

1 比较三组实验兔肺组织干湿重比：取处死实验兔肺组织直接称重，称取肺组织湿质量，后将肺组织置于烘箱内，设置烘箱参数80℃，持续烘干肺组织72 h后取出，称取烘干后肺组织质量，为肺组织干质量，比较三组实验兔肺组织两次称重比值大小。

2 比较三组实验兔肺泡灌注液中IL-8及SPB蛋白水平：取处死实验兔左上肺组织，以10 mL生理盐水经支气管灌洗肺组织，回收灌洗液，后静置回收液，置入离心机3000r离心后，取上清液，采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定灌洗液中IL-8及SPB蛋白表达情况。检测试剂盒购于R&D公司，具体操作按说明书进行。

3 比较三组实验兔肺组织IL-8及SPB蛋白表达情况：取处死实验兔左上肺组织，研磨后加入蛋白裂解液，置入离心机3000r离心后，取上清液加入40μg总蛋白，行凝胶电泳，将结果转移至含有IL-8及SPB蛋白抗体的PVDF膜上，加入洗脱液洗膜后室温下孵育1～2 h，使用Western bolt检测肺组织内IL-8及SPB蛋白表达情况，试剂盒采购于自碧云天生物技术研究所。

四、统计学方法

结 果

一、三组实验兔肺组织干湿重比对比情况

海水组与淡水组W/D较对照组均明显上升，结果具有统计学意义(P<0.05)，且两组兔肺组织W/D无明显差异(P>0.05)(见表2)。

表2 三组实验兔肺组织干湿重比(W/D)

注：与对照组相比，*P<0.05,与海水组相比，两组无明显差异，#P>0.05

二、三组实验兔肺泡灌洗液IL-8及SPB蛋白水平

海水组与淡水组肺泡灌洗液中IL-8水平较对照组表达均上升，SPB蛋白较对照组明显下降，结果具有统计学意义(P<0.05)，且两组兔肺泡灌洗液中IL-8及SPB蛋白水平无明显差异(P>0.05)(见表3)。

表3 三组实验兔肺泡灌洗液IL-8及SPB蛋白表达情况

注：与对照组相比，*P<0.05,与海水组相比，两组无明显差异，#P>0.05

三、三组实验兔肺组织IL-8及SPB蛋白表达情况

海水组与淡水组肺组织中IL-8水平较对照组表达均上升，SPB水平较对照组明显下降，结果具有统计学意义(P<0.05)，且两组兔肺组织中IL-8及SPB蛋白表达无明显差异(P>0.05)(见图1)。

图1 三组实验兔肺组织IL-8及SPB蛋白表达

讨 论

淹溺死亡是常见的死亡因素，近年来流行病学统计显示，淹溺型急性肺损伤所致死亡事件以上升至各意外死亡事件中第二位，特别对于儿童患者，淹溺所致急性肺部损伤已成为儿童意外死亡主要原因之一，儿童因低氧耐受时间短，肺泡组织发育不完全等因素，导致儿童淹溺型急性肺损伤发生速度快，症状更严重，死亡率更高，故该病治疗及其损伤通路研究是临床研究热点问题[10-11]。

淹溺型肺损伤主要可分为海水所致肺损伤与淡水所致肺损伤两种类型，因海水与淡水主要溶质成分、理化性质不同，损伤机制也有所差异：一般认为高渗透海水能直接破坏肺上皮细胞，破坏该处通透性，导致肺水肿发生，而淡水型肺损伤主因低渗透压液体渗入肺泡组织内，导致肺水肿发生，同时可被血液循环吸收，从而引起免疫激活以及溶血反应发生，进一步可致弥漫性血管炎症发生[12-13]。两者发生机制虽有不同，但都直接损伤肺组织，导致肺水肿发生，肺泡表面稳定性下降，影响肺通气换气功能，同时均引起广泛炎症发生，导致肺组织进一步受损，引起不可能肺部损伤，最终致使低氧血症，呼吸衰竭发生[14-15]。

IL-8属细胞白介素成员，是一种多源性细胞炎症因子，是由单核细胞，巨噬细胞等炎症细胞所分泌的，其具有白细胞趋化作用，且能诱导其他趋化因子，黏附因子合成，特别是对于T淋巴细胞及中心粒细胞，其具有强趋化激活作用，能够使其在局部聚集，产生大量炎症活性物质，引起炎症反应发生[16-17]。表面活性蛋白家族(SP)是一种由肺泡内皮细胞分泌的，构成肺表面活性物质的主要蛋白结构，SPB为其主要分泌蛋白，其能保持肺泡稳定性，降低表面张力，维持通气血流平衡，在急性肺损伤过程中，表面活性物质质量与性质改变与病程发展直接相关[18]。研究发现SPB蛋白能维持表面活性物质中磷脂分子结构稳定，其能调节单分子与双分子层结构与形态，使表面张力稳定在合适范围内，避免肺不张发生，其还可在低氧环境下保证肺通气换气过程正常进行，起到肺组织保护作用[19]。

本研究拟探究IL-8与SPB蛋白在淹溺型肺损伤中的表达情况，试探究其在淹溺型肺损伤中的表达意义。建模采用动物实验中心饲养成年新西兰兔，麻醉气管插管完成后，经气管插管向气管内注射3 mL/kg配置海水完成海水组建模，经气管插管向气管内注射18 mL/kg配置淡水完成淡水组建模。既往实验认为，海水中溶质与淡水溶质差异大，海水组使用与淡水组兔相同剂量建模时，已造成模型多器官损伤发生，造成非实验影响因素增加，实验误差增加，在既往报道中认为，该建模方式两组新西兰兔单纯肺部损伤、低氧、组织炎症发生程度相似，故本文采用此建模方式[12]。

实验结果显示，海水组与淡水组W/D较对照组均明显上升(P<0.05)，且两组兔肺组织W/D无明显差异(P>0.05)；提示两组模型肺损伤程度相近。同时海水组与淡水组肺泡灌洗液中IL-8表达量较对照组表达均上升，SPB蛋白较对照组明显下降(P<0.05)，且两模型组兔肺泡灌洗液中IL-8及SPB蛋白表达无明显差异(P>0.05)；海水组与淡水组肺组织中IL-8水平较对照组表达均上升，SPB水平较对照组明显下降，结果具有统计学意义(P<0.05)，且两组兔肺组织中IL-8及SPB蛋白表达无明显差异(P>0.05)。

既往文献报道及结合本文实验结果，3 mL海水与18 mL淡水造模两组兔肺损伤程度相近，两组建模具有对比价值[2]。既往文献报道两种模型中的淹溺型急性肺损伤可能存在机制差异，但本文结果提示，在损伤程度相近时，两组实验兔IL-8及SPB蛋白在两种损伤模型中的表达情况情况相近，故可认为不同机制下，淹溺型急性肺损伤实验兔肺组织内IL-8及SPB蛋白均出现异常表达，可能参与急性肺损伤形成过程[17]。

我们认为出现以上结果原因是：1)淹溺型急性肺损伤发生，无论是海水导致还是淡水导致，其重要机制均为广泛肺部炎症发生，在海水型淹溺肺损伤实验中，高渗性海水直接破坏肺泡壁完整性，导致肺上皮细胞受损，炎症因子分泌增加，故导致IL-8浓度明显上升，而在淡水型淹溺肺损伤实验中，低渗性淡水直接进入血管，导致炎症反应激活，IL-8分泌增加，引起炎症趋化作用发生；2)在海水型淹溺肺损伤实验中，高渗性海水破坏肺泡完整性，导致肺上皮组织功能障碍，SP主要由肺上皮细胞分泌，SPB为其主要活性成分，故SPB在海水型淹溺肺损伤中表达明显下降，而淡水型淹溺肺损伤实验中，低渗性淡水直接进入肺泡，导致肺泡内低渗透压，液体进入肺泡组织，导致肺水肿发生，影响肺上皮细胞分泌功能，导致SPB分泌减少；3)两型淹溺肺损伤均造成肺部广泛炎症发生，直接破坏肺上皮细胞功能，也导致SPB分泌较对照组明显减少。另外我们注意到尽管海水与淡水致肺损伤机制并不完全相同，但实验结果相近，这可能是因为尽管两者致损原因不同，但均是引发炎症浸润，破坏正常肺组织，故两者肺损伤病理结果相近，且IL-8与SPB蛋白均在该病理变化过程中承担重要作用，病理标本中IL-8与SPB蛋白表达量相近。

海水组及淡水组淹溺型急性肺损伤实验兔肺泡灌洗液 及肺组织IL-8及SPB蛋白表达量水平均明显上升，SPB水平均明显下降，提示IL-8表达增多及SPB蛋白表达下调参与该损伤发生过程密切相关。