支气管肺发育不良患儿气管抽吸物单核细胞检测的临床意义研究

邱成英 朱道谋 邓颖云 卢磊 邢舒旺 曾唯峰

支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)是早产儿常见的慢性呼吸系统疾病，由于肺发育不成熟以及肺表面活性物质缺乏，早产儿特别是胎龄<32周的极早产儿BPD的发病率可以达到70%以上[1]。BPD病因复杂，发病机制尚未明确，近期的研究显示肺部炎症失调，可以阻碍肺发育[2]，单核细胞是机体内常见的炎性细胞，其可以分为M1(经典活化巨噬细胞)和M2(替代活化巨噬细胞)两个亚型，在炎症反应中分别发挥不同的作用[3]。本研究检测了BPD患儿气管抽吸物中单核细胞亚型的变化，借此探讨其与BPD的相关性。

资料与方法

一、研究对象

选取我院2018年 1月至 2019 年6月需要机械通气治疗的呼吸窘迫综合征(RDS)早产儿62例，超过28天仍氧依赖患儿为BPD组，氧依赖未到28天患儿为对照组，纳入对象：符合RDS[4]和BPD[5]诊断标准。排除标准：伴发先天性心脏病、肺畸形、遗传代谢病或者难以获得气管抽吸物患儿。

二、单核细胞亚型的检测

使用流式细胞仪(美国BD公司，LSRFortessa)检测患儿气管抽吸物中单核细胞亚型M1和M2所占的比例。FITC-CD68、FITC-CD86和FITC-CD163抗体购自美国Abcam公司，检测方法简述如下：患儿气管抽吸物加入等体积的PBS缓冲液(含1%胰蛋白酶)，37 ℃消化90 min，1000 g离心10 min，收集细胞沉淀，0.5 mL PBS悬浮细胞，每份样品按照抗体试剂盒说明书分别加入FITC-CD68、FITC-CD86或FITC-CD163，避光染色60min，置冰上送流式细胞仪检测，以FL1通道做门，检测CD68阳性单核细胞、CD86阳性M1和CD163阳性M2所占的比例。

三、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素 1(IL-1)和白介素 10(IL-10)的检测

使用ELISA法检测患儿气管抽吸物中TNF-α、IL-1和IL-10表达水平。检测试剂盒购自北京擎科新业生物技术有限公司，检测方法简述如下：患儿气管抽吸物加入4倍体积的4%氢氧化钠，37 ℃ 液化2 h，1000 g离心10min，取上清，按照试剂盒说明书加入相关试剂，美国贝克曼库尔特公司生产AU5800全自动生化分析仪检测各样品吸光度值的变化，对照标准曲线计算各样品中TNF-α、IL-1和IL-10表达水平。

四、统计学分析

SPSS 16.0统计软件对数据进行统计学处理，计量资料用t检验；计数资料采用χ2检验，P<0.05为统计学有显著性差异。

结 果

一、两组早产儿一般临床资料的比较

从表1可见两组早产儿性别比例无显著性差异(P> 0.05)，BPD组胎龄和出生体重显著低于对照组(P<0.05)，用氧时间和机械通气时间显著高于对照组(P<0.01)(见表1)。

表1 两组早产儿一般临床资料的比较

二、两组早产儿单核细胞以及其M1和M2亚型比例的比较

两组早产儿气管抽吸物中单核细胞比例无显著性差异(P>0.05)，BPD组M1占7.65±1.28%，显著高于对照组的3.57±0.54%(P<0.01)，BPD组M2占3.38±0.44%，显著低于对照组的7.35±1.32%(P<0.01)(见表2，图1)。

表2 两组早产儿单核细胞以及其M1和M2亚型的比较

三、两组早产儿TNF-α、IL-1和IL-10表达水平的比较

BPD组早产儿气管抽吸物中TNF-α和IL-1表达显著高于对照组(P<0.01)，BPD组IL-10表达显著高于对照组(P<0.01)(见表3)。

表3 两组TNF-α、IL-1和IL-10表达水平的比较

讨 论

支气管肺发育不良(BPD)是早产儿最常见的后遗症，近年来随着早产儿存活率提高，BPD发生率也逐渐提高[6]，BPD患儿预示着慢性呼吸障碍和神经发育迟缓等不良后果，积极有效防治BPD是早产儿恢复正常生活质量的有力保障[7]。早产和出生低体重是BPD的重要危险因素，本研究观察也显示了BPD患儿胎龄和出生体重显著低于对照组。

炎症在BPD致病中发挥着重要的作用，临床上皮质类固醇可以显著降低BPD发生率以及严重程度，说明了调节炎症反应可以预防早产儿BPD的发生[8]，单核巨噬细胞是炎症常见的浸润细胞[9]，但本研究显示BPD组和对照组气管抽吸物中单核细胞比例无显著性差异，最近研究显示单核细胞分为M1和M2两种亚型，单核细胞向M1极化时细胞主要分泌TNF-α和IL-1促进炎症发生，向M2极化时分泌IL-10减轻炎症过程，促进组织修复和再生[10]。在哮喘的研究中发现M2具有促进组织重建和恢复肺组织微环境平衡的作用[11]，孙瑶[12]等的研究显示间充质干细胞诱导单核巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化后可以治疗急性肺损伤，上述结果说明了单核细胞的不同极化表型是一些炎症性损伤的调节反应。本研究观察发现BPD组患儿气管抽吸物中M1所占比例显著高于对照组，而M2所占比例又显著低于对照组。上述结果说明了BPD患儿单核细胞向M1极化增多，而向M2极化减少，进一步研究单核细胞极化机制，或者调解极化方向将会为BPD提供一个很好的治疗策略。

图1 单核细胞以及其亚型的流式细胞仪检测

综上所述，本研究显示BPD患者单核细胞主要向M1亚型极化，M1比例升高的早产儿要注意预防发展成BPD的可能，调控单核细胞向M2极化有可能成为BPD治疗的靶点。