肺结核病患者外周血α-防御素HNP1-3的表达及意义

罗槑 刘勇 罗东霞 徐园红 朱玛 黄涛

结核病是全球关注的公共卫生问题。虽然目前已有有效的化疗手段及疫苗，结核病的治愈率可达到85%～95%，但是由于结核合并艾滋耐药率的增加、耐多药结核病(multi-drug resistant tuberculosis, MDR-TB)广泛耐多药结核病(extensive drug resistant tuberculosis, XDR-TB)的出现，免疫抑制剂的使用等原因，还是有部分患者复发，甚至还有部分患者因为治疗失败成为复难治结核，成为耐药结核的传播源，成为公共健康的巨大隐患，也加重了社会的经济负担,因此还需加强抗结核防控等方面的研究。

人α-防御素主要有存在于中性粒细胞的HNP1-HNP4(human neutrophil peptide1-4, HNP1-HNP4)及存在于小肠潘氏细胞DEFA5(Human Defensin 5, DEFA5)和 DEFA6(Human Defensin 6，DEFA6)[1-2]。HNP具有广谱抗菌活性，其通过增加微生物细胞膜通透性来清除病原微生物[3]，当机体受到病原微生物感染入侵时，机体受到病原刺激，引起中性粒细胞HNP的广泛表达，并立即聚集到炎症部位直接杀死病原体，是机体先天免疫的重要组成部分。因此，HNP在结核病感染过程中也起着重要作用，当在机体受到结核分枝杆菌的入侵时，HNP作为先天性免疫的直接效应分子，成为抗菌的第一道防线。

人中性粒细胞肽1-3(human neutrophil peptide1-3, HNP1-3)除 N 端的第 1 个氨基酸不同，其它氨基酸序列几乎完全相同，由于差别极小实验检测不易区分，通常检测HNP1-3总的基因表达。近年来已有研究显示多种炎症性肺部疾病与HNP有密切联系，但结核病患者中性粒细胞肽HNP1-3表达与疾病关系的研究还较少。因此，我们通过检测结核病患者及健康对照组血清HNP1-3浓度及中性粒细胞HNP1-3的mRNA表达水平，探索HNP1-3水平与疾病病情及预后的关系。

资料与方法

一、主要试剂

人中性粒细胞防御素HNP1-3、IL-8酶联免疫试剂盒购于武汉华美生物工程公司CUSABIO；人外周血中性粒细胞分离液购于天津灏洋生物科技有限公司；RNA提取试剂盒购于天根生化科技有限公司；引物由invitrogen合成；反转录、荧光定量SYBR Green PCR Master Mix试剂均购于罗氏(Roche)公司，运用ABI7500实时荧光定量PCR仪检测。

二、纳入病例来源

肺结核组入组研究对象来源于成都市公共卫生临床医疗中心2016年1月至2018年6月住院患者，按照《肺结核诊断标准》(WS 288-2008)[4]、《肺结核诊断标准》(WS 288-2017)[5]经临床诊断为初/复治肺结核患者。

健康对照组来源于通过公开招募入组的健康志愿者，无重大疾病病史，经体检显示身体健康，2周内未服用过任何药物者纳入研究。

三、方法

1.肺结核组患者外周血均为入院首次采集，血液外周血白细胞及中性粒细胞计数由本院医学检验科完成，检测仪器为希森美康血球分析仪XT-2000i。

2.外周血中性粒细胞的分离：分别采集结核病组与健康对照组空腹静脉血5 mL，EDTA抗凝，运用中性粒细胞分离液以500 g离心25 min，获得富集的中性粒细胞。加入1 mL TRIzol，-80度保存细胞。

3.中性粒细胞总RNA的提取：按照试剂盒说明书，通过前处理、裂解、抽提、沉淀、洗涤、溶解等步骤，得到中性粒细胞总RNA。运用超微量紫外分光光度计检测RNA浓度及比值。

4.RNA反转录: RNA 1ul(1ug/ul), random hexamer prmier 2ul，water 10ul,65℃ 10min；Transcript Reverse Transcriptase Reaction Buffer 4ul，Protease RNase Inhibition 0.5ul，Dexoynucleotide Mix 2ul，Transcriptor Reverse Transcriptase 0.5ul，total volume 20ul，25℃10 min,50℃60 min,85s℃5 min，得到cDNA，用DEPC水按一定比例稀释后使用。

5.实时荧光定量(qPCR)：HNP1/3上游引物：5′-ATGAGGACCCTCGCCATCCTTGCT-3′，下游引物：5′-TCAGCAGCAGAATGCCCAGCGTCTTCCC-3′。反应体系为：cDNA 4 μl，Primer F 0.4 μl，Primer R 0.4 μl，SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，ddH2O 5.2 μl, total volume 20 μl。上机检测反应条件：95℃ 2 min，95℃ 15s，60℃ 15s，35个循环。相对定量采用2-△△Ct法计算HNP1-3 mRNA在疾病组水平相对于健康对照组人倍数。

6.运用酶联免疫吸附实验(ELISA)：每孔分别加标准品或者待测血清样本，37℃ 2 h；弃去液体，每孔加生物素标记抗体100 μl，37℃ 1 h；洗板；每孔加辣根过氧化酶标记亲和素工作液100 μl，37℃ 1 h；洗板；依序每孔加底物溶液90 μl，37℃避光显色15～30 min；依序每孔终止液50 μl；反应终止后5 min内用酶标仪450nm检测吸光度(OD值)。血清HNP1-3浓度计算运用Curve Expert软件进行数据处理分析。

四、统计学处理

结 果

一、入组研究对象基本情况

本研究一共入组199例研究对象，其中肺结核组113例，健康对照组86例。病原学阳性肺结核63例，病原学阴性肺结核50例；初治肺结核75例，复治肺结核38例；重症肺结核62例，轻症肺结核51例；肺结核合并糖尿病25例(见表1)。两组研究对象年龄、性别比例差异无统计学意义。

表1 入组研究对象人口学资料

二、肺结核患者外周血中HNP1-3水平及中性粒细胞HNP1-3的mRNA表达情况

两组研究对象外周血清HNP1-3水平有明显差异，肺结核组(TB, tuberculosis)HNP1-3平均值为22.6ng/mL(n=113、22.6±14.4 ng/mL)，健康对照组(Healthy control)平均值为16.1ng/mL(n=86、16.1±5.7 ng/mL)(见图1A)。肺结核组与同健康对照组相比，肺结核组外周血HNP1-3水平显著增高(t=4.008、P<0.001)。同时，两组外周血中性粒细胞HNP1-3在mRNA表达水平上的差异也表现为肺结核组HNP1-3的mRNA表达高于健康对照组，表达量升高2.17倍，但两组差异无统计学意义(图1B，n=6、t=2.221、P=0.051)。

图1A 肺结核与健康对照组外周血HNP1-3水平；图1B 肺结核与健康对照组外周血中性粒细胞HNP1-3mRNA表达水平

三、肺结核患者外周血HNP1-3与疾病病情的关系

由图2A可见，病原学阳性肺结核组TB(+)外周血HNP1-3水平(n=63、23.5±14.5 ng/mL)高于病原学阴性肺结核组TB(―)外周血HNP1-3水平(n=50、20.0±10.4ng/mL)，但差异无统计学意义(t=1.360、P=0.175)。初治肺结核组(new tuberculosis, NTB)外周血HNP1-3水平(n=75、22.1±13.7 ng/mL)低于复治肺结核组(recurrent tuberculosis, RTB)外周血HNP1-3水平(n=38、23.8±15.7ng/mL)，两组差异无统计学意义(图2B,t=0.596、P=0.552)。重症肺结核组患者外周血HNP1-3水平(n=62、25.2±16.3ng/mL)高于轻症肺结核组(n=51、19.5±11.0ng/mL)，两组差异有统计学意义(图2C，t=2.098、P=0.038)。肺结核合并糖尿病组(TB+DM)患者外周血HNP1-3水平(n=25、28.6±13.9ng/mL)高于未合并糖尿病肺结核组(TB，n=88、20.9±14.1ng/mL)，两组差异有统计学意义(图2D，t=2.398、P=0.018)。

四、肺结核患者外周血HNP1-3与IL-8、中性粒细胞的关联

图2A 病原学阳性组与病原学阴性组外周血HNP1-3水平；图2B 初治组与复治组外周血HNP1-3水平；图2C 轻症组与重症组外周血HNP1-3水平；图2D 肺结核与肺结核合并糖尿病组外周血HNP1-3水平

通过Pearson相关分析，肺结核患者外周血HNP1-3水平与炎症指标IL-8呈正相关(r=0.454、P=0.002)、与中性粒细胞比例呈相关(r=0.422、P=0.045)(见表2)。

表2 肺结核患者外周血HNP1-3、IL-8、中性粒细胞比例相关性

注：*P<0.05;**P<0.01

讨 论

根据WHO最新2018全球结核病报告显示，虽然结核病的防控取得了较好的成效，我国仍是结核病高负担国家之一，而在结核病的检测和治疗上还持续存在很大的差距[6]。结核病的免疫反应是由细胞免疫介导，因此基于HNP的天然防御和免疫调节功能，近年来研究认为HNP对结核病的发生与转归有重要影响。作为机体抵抗病原感染的第一道防线，来源于中性粒细胞的HNP1-3在机体感染结核分枝杆菌时的免疫反应中也起到重要作用。

近年来研究显示HNP1-3具有多种生物学作用：(1)具有广谱抗菌活性，可有效的杀伤病毒[7-8]、真菌[9]、细菌[10-11]等多种微生物；(2)有抑制肿瘤细胞作用[12]；(3)免疫调节作用[13]，还与老年人群对感染性疾病的易感性相关[14]。迄今，也有多项研究证实HNP1-3对结核分枝杆菌的抑制作用[15]：Miyakawa Y 等研究证实HNP1-3可抑制结核分枝杆菌生长[16]；在结核分枝杆菌毒株感染小鼠模型中，HNP1能显著地清除感染小鼠肺、肝脏及脾脏中的病原菌[17]；在活动性肺结核患者的血浆及支气管肺泡灌洗中也报道了HNP1-3的增加[18]。

HNP1-3在成熟中性粒细胞中未被诱导的情况下是处于低转录水平[19]，因此在健康人群的含量很低。当中性粒细胞活化后，会迅速释放HNP，参与宿主防御和介导炎症反应[20-21]。我们的研究显示，在分枝杆菌感染状态下，结核病患者外周血中性粒细胞HNP1-3的 mRNA的上调、外周血清HNP1-3水平的增加，提示分枝杆菌感染引起中性粒细胞活化促进HNP的产生，从而有助于分枝杆菌的清除。同时，为了进一步探索HNP1-3与疾病病情与预后的关系，我们发现肺结核患者重症组外周血HNP1-3显著高于轻症组，推测过高HNP1-3水平与病情严重程度有关；而糖尿病是已知与结核病预后如治疗失败[22]、复发[23]甚至死亡[24]的危险因素之一，所以我们还比较了是否合并糖尿病的两组肺结核患者的血清HNP1-3水平，结果显示结核病合并糖尿病患者外周血HNP1-3水平显著增高，也提示HNP1-3与病情严重程度及预后有关联。由于HNP还参与炎症、抗原免疫递呈等免疫调控过程，IL-8 是很强的中性粒细胞趋化因子[25]，且在呼吸道上皮细胞由HNP1-3介导释放，因此我们分析了结核病患者外周血HNP1-3与IL-8及中性粒细胞比例的相关性，发现HNP1-3与两者之间均呈正相关，进一步说明了升高的HNP1-3在执行分枝杆菌清除功能的同时，可能通过促进IL-8募集更多中性粒细胞形成炎症不断累积的过程，从而与病情加重有关。有研究报道低水平的HNP1-3与耐多药结核病(multi drug resistance tuberculosis, MDR-TB)密切相关[26]，提示HNP1-3水平在疾病过程中的两面性：增高虽有利于分枝杆菌的清除但也有可能通过促进炎症加重来影响疾病进展及预后。Kumar N等[27]报道了肺结核患者HNP1-3与有无空洞、双肺或单侧病灶、病原涂片阳性级别等疾病严重程度和病原负担等指标无直接关联，这可能是由于研究的纳入标准、地区、以及研究对象处于病情、病程阶段不同都有一定关系，这需要我们在今后的工作再进一步深入探索。

总之，本研究报道了相对于健康对照人群，分枝杆菌感染的状态可诱导防御素HNP1-3的mRNA表达上调和外周血蛋白水平增加，且与疾病病情、预后及炎症指标呈正相关，提示HNP1-3可作为疾病病情及预后判断的辅助指标，但还需要在进一步的工作中结合不同病程转归的动态观察再深入探索。同时，由于防御素广谱的抗菌、抗病毒活性，加之其特殊的作用机理因此不容易诱导产生耐药性，本研究也为使用防御素应用于临床治疗提供了新思路。