一例雏鸡肠炎沙门氏菌的分离培养及药敏试验

□赵姗姗 王雨蒙 李洁 夏颖 薛晓阳（华裕农业科技有限公司，河北省蛋鸡产业技术研究院）

某养殖户送检1 日龄雏鸡10只，临床症状：糊肛，大肚子。 通过剖检，临床症状观察，采取肝脏、卵黄、盲肠等组织病料，使用BPW 缓冲蛋白胨水对病料进行增菌培养； 显色培养基鉴别培养； 进行了沙门氏菌生化试剂盒：三糖铁、靛基质、尿素酶、氰化钾、赖氨酸脱羧酶等生化试验；血清分型；结合临床症状、病理变化、实验室诊断为肠炎沙门氏菌，并进行药敏试验， 该分离株对环丙沙星、头孢噻肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、庆大霉素、阿米卡星敏感，对青霉素、头孢噻吩无效果。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源

河北某养殖户送检1 日龄雏鸡10 只，病料取肝脏、卵黄、盲肠，进行分离。

1.1.2 培养基

缓冲蛋白胨水（BPW）：（蛋白胨10 克、 氯化钠5 克、 磷酸氢二钠9克、磷酸二氢钾1.5 克）；

四硫磺酸盐煌绿增菌液基础（TTB）：（蛋白胨9 克、 牛肉粉4.5克、氯化钠2.7 克、碳酸钙40.5 克、牛胆盐5 克、硫代硫酸钠（含5 个结晶水）50 克）；

沙门氏菌显色培养基：(氨基酸对照、赖氨酸、氰化钾对照、氰化钾、靛基质、尿素酶、甘露醇、山梨醇、ONP 克)；

三糖铁琼脂（TSI）：(白胨20 克、葡萄糖1 克、肉粉5 克、酚红0.025克、硫酸亚铁铵0.2 克、琼脂12 克、氯化钠5 克、庶糖10 克、硫代硫酸钠0.2 克、乳糖10 克)；

营养琼脂（nutrient agar）：（蛋白胨10 克、 牛肉浸膏3 克、 氯化钠5克、琼脂15 克）；

沙门氏菌干制生化鉴定试剂盒：（三糖铁、靛基质、尿素酶、氰化钾、赖氨酸脱羧酶、 甘露醇、 山梨醇、ONPG）；

沙门氏菌属诊断血清，O 多价A-F 群 血 清、O 因 子 血 清(O4、O9、O12)、H 因子血清（H：克、H：m、H：i、H：2）；

0.5%半固体琼脂：200 毫升（NaCl 2 克, 胰蛋白胨2 克, 酵母浸粉1 克， 琼脂粉1 克, 蒸馏水200毫升）；

Mueller-Hinton 琼脂 （Mueller-Hinton Agar）：牛肉粉6 克、可溶性淀粉1.5 克、酸水解酪蛋白17.5 克、琼脂17 克)。

1.1.3 快速染色液

龙胆紫液、碘溶液、脱色液、沙黄溶液。

1.1.4 药敏试纸

阿米卡星、庆大霉素、青霉素、环丙沙星、头孢哌酮、头孢他啶、头孢噻肟、头孢噻吩、头孢曲松。

1.2 试验方法

1.2.1 样品剖检

剖检样品，观察临床症状，根据其病理变化做出初步诊断。

1.2.2 分离培养

在超净台中无菌操作， 采取卵黄、肝脏、盲肠，进行bpw 缓冲蛋白胨培养基预增菌，37℃温箱培养24小时， 使细菌恢复到稳定的生理状态。

24 小时后对预增菌样品， 进行选择性增菌培养， 在阻止其他大多数细菌增殖的同时， 使预增菌样品中沙门氏菌继续增殖。 在超净台内无菌操作， 使用10 毫升无菌离心管，按1∶9 添加，抽取0.5 毫升样品加入到4.5 毫升TTB 中， 恒温箱42℃培养18～24 小时。

1.2.3 鉴别培养

将选择性增菌TTB 菌液接种到沙门氏菌显色培养基 （科玛嘉），沙门氏菌显色培养基上， 沙门氏菌菌落颜色为淡紫色。 用接种环蘸取TTB 菌液划线接种于显色培养基。于37℃±1℃培养18～24 小时， 观察各个平板上生长的菌落。 恒温箱培养18～24 小时。

1.2.4 纯化菌落

若显色培养基特征性变化符合沙门氏菌， 则对疑似沙门氏菌进行划线法纯化，得到单个菌落，于37℃±1℃恒温箱培养18～24 小时。

1.2.5 生化反应鉴定

将纯化的菌落， 接种于三糖铁琼脂， 先在斜面划线， 再于底层穿刺。 同时接种于生化试剂盒，恒温箱内36℃±1℃培养18～24 小时后观察结果。

1.2.6 血清型鉴定

依次进行自凝性检查、O 抗原鉴定和H 抗原鉴定。

先进行O 抗原A-F 多价血清鉴定，A-F 多价血清凝集，进行O：9、O：12 因子血清鉴定。

O：9、O：12 因 子 血 清 均 出 现 凝集。 进行下一步细菌动力试验H 抗原鉴定，

1.2.7 细菌动力试验

做H 抗原鉴定之前， 须先将菌株接种在0.55%～0.65%半固体琼脂平板的中央，于36℃±1℃，静置培养12 小时，待菌落蔓延生长时，在蔓延生长的边缘部分取菌检查。 则进行H：g 因子血清和H：m 因子血清鉴定，如H：g 和H：m 因 子 血 清 均 产 生 凝集，判定为肠炎沙门氏菌。

1.2.8 药敏试验

对分离到的肠炎沙门氏菌进行药敏试验筛选敏感药物， 方法参照李强关于沙门氏菌分离鉴定及药敏试验的方法， 将分离出的细菌接种于营养肉汤培养基， 于37℃±1℃培养18～24 小时，肉汤培养物变浑浊，取菌液1 毫升覆盖在MH 培养皿表面，使用涂布棒涂布均匀，将药敏片贴于培养基上， 于37℃±1℃恒温箱培养18～24 小时，观察结果，测量抑菌圈大小。

结果判断标准： 测量药敏片抑菌直径大小，观察抑菌圈清晰度，直径小于10 毫米判断该药物低度敏感，10～15 毫米为中度敏感，15～25毫米为高度敏感，25 毫米以上为极度敏感。

2 实验结果

2.1 病理变化

剖检：无明显病理变化。 临床症状：可见雏鸡糊肛、下痢、大肚子。

2.2 菌株形态

通过镜检， 发现两端钝圆，短小，革兰氏阴性杆菌，无荚膜、无芽孢。

2.3 菌株培养特性

显色培养基，菌落为针尖状，淡紫色；三塘铁培养基斜面为黄色，底层为黑色；

营养琼脂培养基，灰白色，呈圆形，稍隆起，光滑边缘整齐。

表1 生化实验结果

表2 药敏试验结果

2.4 生化特性

生化实验结果见表1。

2.5 血清分型

依次进行自凝性检查、O 抗原鉴定和H 抗原鉴定。

菌株未出现自凝，O 抗原A-F多价血清凝集，进行O：9、O：12 因子血清鉴定；均出现凝集。

2.6 细菌动力试验

观察菌株在半固体琼脂上蔓延生长， 挑取蔓延部分进行H 抗原进行H：g 因子血清和H：m 因子血清鉴定，鉴定结果均产生凝集，判定为肠炎沙门氏菌。

2.7 药敏试验

药敏试验结果见表2。

3 讨论

合理应用抗菌药， 控制畜禽疾病的一项重要内容就是通过药敏试验指导临床用药， 以充分发挥抗菌药疗效，并尽可能减少其不良影响，不同地区，不同血清型的菌株对抗生素药物的敏感性不同，建议使用药物预防时，进行药敏试验。

肠炎沙门氏菌， 属于无宿主特异性而有侵害性的病原菌之一，宿主包括人和各种动物。 该菌不仅能引起家禽发病死亡造成严重的经济损失， 而且被污染的家禽产品作为肠炎沙门氏菌的携带者， 还严重危害人类健康。

对于病原菌易产生耐药性，通过耐药数据进行筛选，选出敏感药物后再进行有效治疗，除了使用抗菌药物以外，还可以考虑有效的生物安全措施， 最根本的方法检疫淘汰带菌鸡，建立无菌鸡群，消灭传染源。

4 结论

4.1 根据临床症状、 病例剖检、病料的实验室诊断， 确诊该雏鸡携带肠炎沙门氏菌。 实际生产中多关注大肚子、糊肛此类雏鸡，此类雏鸡易增加患病风险。 建议及时淘汰，不进行饲养。

4.2 鉴定过程中，如果实验室没有PCR 的方法，可通过生化试剂的方法确定沙门氏菌， 使用血清O 抗原、H 抗原来确定沙门氏菌血清型。临床上鸡白痢、禽伤寒、肠炎同属于D 群血清群，鸡白痢、禽伤寒、无鞭毛，肠炎沙门氏菌有鞭毛，可通过细菌动力试验，H 抗原来判断区分。

4.3 药物敏感性试验结果：环丙沙星、头孢噻肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、庆大霉素、阿米卡星等药物敏感，青霉素、头孢噻吩不敏感。