下丘脑cAMP/PKA/PhK/GP通路在脾气虚食少腹胀中的作用研究❋

于化新，马 丹，刘旭东，刘慧慧，王凌志，王 路，单德红，王德山

(辽宁中医药大学基础医学院生理与心理教研室，沈阳 110847)

脾气虚是中医临床常见证，以食少纳呆、腹胀腹泻、神疲乏力、身体消瘦等为主要症状，其中食少纳呆、腹胀腹泻症状的病理生理机制多认为与消化道神经-内分泌功能紊乱有关，但其中枢机制尚不清楚[1-4]。现代医学认为，下丘脑内存在摄食中枢、饱中枢和渴中枢，通过启动和中止进食水冲动，控制消化道活动以维持机体能量稳态。下丘脑神经元极为活跃，能量消耗巨大，当ATP不足时就需要胶质细胞内的糖原分解供能，否则将会引发消化道功能异常[5-6]。研究发现，胶质细胞内的糖原分解受多重因素影响，其中环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)/蛋白激酶A(protein kinase, PKA)/磷酸化蛋白激酶(phosphorylase kinase, PhK)/糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase, GP)通路发挥重要作用[7-9]。脾气虚的食少、腹胀是否与上述通路异常所导致的下丘脑供能不足有关，目前尚不清楚。为此，本研究通过观察脾气虚证模型大鼠24 h进食水量、胃肠蠕动和下丘脑cAMP-PKA-PhK-GP通路的变化，从糖原分解代谢角度探讨下丘脑与脾气虚食少纳呆、腹胀腹泻的关系，为阐明脾主运化功能的科学内涵提供依据。

1 材料

1.1 动物

16只SPF级雄性SD大鼠，体质量200±10 g，购于辽宁省本溪巿实验动物中心(许可证号SCXK(辽)-2010-0001)，饲养于辽宁中医药大学实验动物中心(许可证号SYXK(辽)-2013-000-9)。室温18～23 ℃，相对湿度45%～55%，自由饮水进食，适应性饲养1周后开始实验。研究方案通过辽宁中医药大学实验动物伦理委员会审核(批号20151205)。

1.2 仪器与试剂

iMark酶标仪和电泳仪(美国Bio-Rad公司)；高速冷冻离心机(美国Thermo Scientific)；显影仪(上海天能科技有限公司，Tanon5200)。ATP和cAMP含量测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20171107；20171115)；PKA含量测定试剂盒(北京全式金生物技术有限公司，批号K20103)；BCA法蛋白测定试剂盒(北京全式金生物技术有限公司，批号K20316)；PhK抗体(武汉三鹰生物技术有限公司，批号00016933)；GP抗体(武汉三鹰生物技术有限公司，批号00020262)；GAPDH抗体(武汉三鹰生物技术有限公司，批号10003343)；HRP标记山羊抗兔二抗(北京全式金生物技术有限公司，批号K304223)；HRP标记山羊抗鼠二抗(武汉三鹰生物技术有限公司，批号20000002)；ECL化学发光试剂盒(北京全式金生物技术有限公司，批号K10419)。

2 方法

2.1 分组、模型复制及评价

大鼠按随机数字表法分为正常组和脾气虚证组(以下称模型组)，正常组常规饲养，正常饮食水；模型组大鼠按文献复合中医病因方法[1,10]复制脾气虚证模型，并按成模标准进行评价。即15 d内饱食1 d，禁食2 d，共5个循环，同时每日水温35 ℃～37 ℃游泳至力竭。经评价未达成模标准者剔除，每组终极数为8只。

2.2 大鼠“食少”“腹胀”的评价

按文献方法[11]，前者检测大鼠24 h进食水量，即将大鼠单只放入代谢笼24 h后，计量投食/水量和剩余食/水量，二者差值即为其24 h进食水量；后者按1 ml/100 g 的比例灌服 10% 炭粉混悬液(阿拉伯胶和活性炭各占 10%)，30 min 后 10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔麻醉，开腹取胃和小肠，测量胃内炭末含量、小肠全长及小肠炭粉推进距离，分别计算炭末在胃内的残留率和小肠推进率。

2.3 下丘脑糖原颗粒观察

大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，快速开颅取下丘脑，将大部分-80 ℃冻存备用，少部分在4 ℃下切成约1 mm3小块，2.5%戊二醛固定，PBS漂洗，1%锇酸固定，乙醇、丙酮梯度脱水，环氧树脂包埋聚合，LKB-1型超薄切片机切片，3%醋酸铀-枸橼酸铅双染，透射电镜观察高密度颗粒情况并拍片，检测电压120.0 kV。

2.4 下丘脑ATP、cAMP和PKA水平

采用ELISA法取冻存下丘脑制备组织匀浆，严格按照说明操作，分别检测ATP、cAMP和PKA水平。

2.5 下丘脑PhK和GP表达

采用Western blot法。取冻存下丘脑，解冻后取20～40 mg组织加入200 μL裂解液，30 min后冰上研磨后置于无菌EP管，4 ℃下14000 r/min离心10 min取上清，BCA法测定蛋白浓度；每管加2×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液100 μL，100 ℃变性，按50μg总蛋白上样量计算加样体积，SDS-PAGE凝胶电泳后转膜(25 V，2.5 A，30 min)，按Marker提示切膜标记；室温5%脱脂奶粉/TBST封闭1 h后，分别加入PhK(1∶500)、GP(1∶500)和GAPDH(1∶2000)抗体各4 mL，4℃摇床过夜，TBST洗膜；PhK、GP盒内各加入4 mL HRP标记山羊抗兔二抗(1∶2000)，GAPDH盒内加入4 mL HRP标记山羊抗鼠二抗(1∶2000)，室温摇床孵育1 h；TBST洗膜，加入ECL发光液曝光显影。应用AlphaView SA软件检测相关蛋白的相对表达量。

2.6 统计学方法

3 结果

实验过程中没有动物死亡及脱失现象。造模结束后，模型组大鼠出现消瘦、食少、神疲乏力和毛色枯槁无华等表现，表明脾气虚证大鼠模型复制成功。

3.1 脾气虚证大鼠的进食水量、胃残留率和小肠推进率变化

表1显示，与正常组比较，模型组大鼠的进食量、饮水量及小肠推进率下降(P<0.01，P<0.05，P<0.01)，但胃残留率上升(P<0.01)，差异有统计学意义。

表1 脾气虚证大鼠进食与胃肠功能变化比较

注：与正常组比较：*P<0.05，**P<0.01

3.2 脾气虚证大鼠下丘脑糖原颗粒变化

图1显示，正常组和模型组均存在大量高密度颗粒(箭头所示)，提示2组大鼠下丘脑内糖原均较多。

注：M.线粒体；N.细胞核图1 透射电镜观察2组大鼠下丘脑糖原颗粒情况(25000×)

3.3 脾气虚证大鼠下丘脑ATP及cAMP-PKA-PhK-GP通路相关指标变化

表2图2显示，与正常组比较，模型组大鼠下丘脑组织ATP、cAMP和PKA水平下降(P<0.01,P<0.01,P<0.05)，差异有统计学意义；Western blot法检测结果显示，与正常组比较，模型组大鼠下丘脑组织PhK和GP表达光密度值下降(P<0.05)，差异有统计学意义。

表2 下丘脑ATP及cAMP-PKA-PhK-GP通路相关指标变化比较

注：与正常组比较：*P<0.05，**P<0.01

图2 脾气虚证大鼠下丘脑PhK和GP表达比较

4 讨论

大鼠脾气虚证模型的复制方法较多。本研究采用中医学复合病因造模更接近于脾气虚证的形成机制，增加了模型的可信度。模型复制结果显示，模型组大鼠的24 h进食水量明显低于正常组，说明该组大鼠出现“食少”；模型组大鼠胃残留率和小肠推进率分别显著高于和低于正常组，表明该组大鼠出现“腹胀”，“食少”与“腹胀”作为脾气虚的主要症状，其发生机制尚未进行研究。

现代医学认为，进食水冲动和胃肠活动主要受控于下丘脑，因为下丘脑还在内分泌、体温维持和情绪形成等方面具有重要作用，所以下丘脑能量消耗巨大。中枢神经元的能量源于血糖，不足时由储存于星形胶质细胞内的糖原补充，其动员过程与神经元放电相偶联。神经元兴奋的基础是Na+内流和K+外流，正常情况下神经元膜上的Na+-K+泵能够将离子复位，维持膜内外正常的离子分布，但ATP不足将导致胞外高K+，如不及时干预则会导致神经元过度兴奋。星形胶质细胞膜上也存在Na+-K+泵，能够辅助神经元纠正胞外高K+，但因为与K+的亲和力较低，其激活主要依靠胞内高Na+[12-13]。介导Na+内流的途径较多，其中Na+-HCO3-同向转运体在转运Na+的同时，也运进大量的HCO3-，继而激活腺苷酸环化酶，促进ATP分解为cAMP，从而提高PKA水平[14-15]。PhK是PKA的靶蛋白之一，其上调可激活GP，从而分解糖原[7,16]。脾气虚时下丘脑cAMP-PKA- PhK-GP通路的变化目前还没有报道。

研究结果显示，模型组下丘脑组织中ATP水平明显低于正常组，但电镜结果却显示模型组与正常组的下丘脑内均存在大量糖原颗粒，表明脾气虚状态下，下丘脑神经元供能已然不足，但糖原储备却未见明显减少，提示脾气虚时下丘脑的糖原动员途径可能出现障碍。进一步研究显示，模型组下丘脑的cAMP和PKA水平明显下降，PhK和GP表达显著下调，表明下丘脑cAMP-PKA-PhK-GP通路抑制。由此推测，脾气虚时下丘脑内的糖原无法及时分解供能，导致相关神经元因缺乏后续能量补充而出现功能紊乱，从而引发起机体不能正常进行消化吸收。因此本研究认为，脾气虚食少纳呆、腹胀等消化道功能改变，可能与cAMP-PKA-PhK-GP通路抑制所导致的下丘脑能量供给不足有关，下丘脑可能是调控脾主运化系统功能的中枢部位之一。