补阳还五汤对高血压模型大鼠心肌组织中AngⅡ/AT1R与PI3K/AKt轴的影响❋

曲 怡，王建波，薛亚楠，邓婷月，勇入琳，刘 路，张立德

(辽宁中医药大学中医脏象理论及应用教育部重点实验室，沈阳 110847)

高血压是指以体循环动脉血压(收缩压和/或舒张压)增高为主要特征(收缩压≥140 mmHg，舒张压≥90 mmHg)，可伴有心脑肾等器官的功能或器质性损害的临床综合征[1]。研究显示，高血压可导致血流动力学和神经体液等诸多异常变化，是引起心肌病理性改变的重要疾病之一。高血压患者同时存在的压力负荷和容量负荷均可增加心肌细胞容积，增大心肌细胞尺寸，改变胶原蛋白基质成分而最终引起心肌肥厚，是引起脑卒中、冠心病和肾功能损伤等疾病的重要危险因素。中医将其归属于“眩晕”“头痛”“肝风”等病证范畴。近年来中医药治疗高血压病取得了一定成效，并充分体现了临床的实用价值[2-4]。

现代研究证实，肾素血管紧张素系统(RAS)参与高血压的发病和心房重塑，血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)与其主要受体血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)结合后可改变心肌离子通道表达及功能，促进组织氧化张力及炎症反应，引起心房纤维化和心肌肥大等[5]。磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路是胰岛素调节细胞生理功能的主要信号通路，具有抗氧化、抗凋亡等心肌保护作用；原发性高血压由于RAS过度激活，打破了RAS与胰岛素信号之间串活平衡的本质，是RAS的主要效应因子AngⅡ表达上调后抑制了胰岛素信号通路PI3K/AKT的活性[6-8]。研究发现，补阳还五汤在改善血液流变学、保护血管内皮细胞功能和逆转高血压左室肥厚、改善高血压患者左室舒张功能方面均有明显疗效[9-10]。

因此，本实验拟通过观察补阳还五汤对高血压模型大鼠的AngⅡ/AT1R与PI3K/AKt信号通路的影响，阐释补阳还五汤对高血压所致心肌损伤的保护机制。

1 材料

1.1 动物

实验动物由北京维通利华实验动物技术有限公司提供：7周龄盐抵抗大鼠(SS)10只，体质量190～210 g(许可证编号SCXK(京)2016-0006)；7周龄盐敏感大鼠(DS)30只体质量190～210 g(许可证编号SCXK(京)2016-0006)。饲养环境：辽宁中医药大学实验动物中心，温度为22±1 ℃，湿度为45±5%。

1.2 仪器及试剂

智能无创血压计(BP-2010 A日本)；荧光定量PCR仪(Applied Biosysterms 7500 Fast Real-Time PCR Systerm)、ABI Veriti 梯度PCR仪器(Applied Biosystems)、超微量紫外分光光度计(NanoDrop2000)、多功能酶标仪(SpectraMax I3,奥地利MD公司)。Trizol® Reagent(Invitrogen life technologies)；引物设计合成(北京博迈德基因技术有限公司)、PCR反转试剂盒(ProtoScript First Strand cDNA Synthesis Kit)、荧光定量PCR试剂盒(Agilent Technologies)；MinuteTM总蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量测定试剂盒(凯基生物)、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(凯基生物)、一抗兔抗大鼠AT1R(北京博奥森生物技术有限公司，bs-0630R)；AngⅡ ELISA试剂盒(Biotech公司，Cat.#EIA-3667)。

1.3 药物制备

补阳还五汤，药用：黄芪30 g，赤芍4.5 g，川芎3 g，当归6 g，地龙3 g，桃仁3 g，红花3 g；以上剂量为成人一日剂量，共52.5 g，按照成人和大鼠给药量换算，100 g大鼠给药量为0.55 g。将补阳还五汤水浓缩至0.55 g/ml后，分装置于4 ℃冰箱保存备用(中药购自辽宁省中医院中药局)。缬沙坦由鲁南贝特制药有限公司提供。

2 方法

2.1 分组与造模

所有大鼠统一于SPF级动物中心适应性饲养7 d后开始实验。SS大鼠10只为正常组；DS大鼠30只随机分为模型组、中药组、西药组。8% Nacl高盐饲料(北京科奥协力饲料有限公司提供)喂食28 d，期间采用智能无创血压计监测大鼠血压，28 d后当血压值升至140 mmHg/90 mmHg以上时，确定为高血压大鼠模型。停止高盐喂养改为普通饲料(辽宁本溪长生生物技术有限公司提供)喂养。中药组和西药组分别给予补阳还五汤、缬沙坦灌胃治疗，饲养期间自由饮食饮水。

2.2 干预方法

中药组大鼠给药量(大鼠体质量每100 g给药量为0.55 g/ml)，西药组大鼠给药量(3 mg/100 g大鼠)[11]，正常组和模型组大鼠给予等量蒸馏水灌胃，每天灌胃1次，连续灌胃5周。

2.3 取材

灌胃治疗5周后，各组大鼠禁食不禁水12 h，10%水合氯醛腹腔麻醉(4 ml/kg体质量)，待大鼠完全麻醉后打开大鼠胸腔，剪取左心室心肌组织置于无菌EP管内，迅速液氮浸泡后冻存于-80 ℃冰箱待用。

2.4 检测方法

2.4.1 大鼠血压的测量 测量方法：于安静封闭的环境中，接好电源，打开主机，待设定温度升高至39 ℃，将大鼠置于系统固定容器内，将感应器穿过鼠尾并固定于鼠尾根部，松紧适度，待动物安静后尾套充气系统自动加压放气，血压仪显示屏上观察老鼠的血压波形并记录，每只大鼠重复测量3次取平均值。每只大鼠测量时间为30 min，避免大鼠躁动对血压造成影响。

2.4.2 ELISA法检测大鼠左心室心肌组织AngⅡ含量 取左心室心肌组织100 mg，加入PBS制成10%组织匀浆液，离心后取上清；设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL，样本孔加入待测样本50 μL，空白孔不加；除空白孔外其余各孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100 μL，封板膜封住反应孔，37 ℃水浴60 min；弃去液体，洗涤液反复洗涤5次；每孔加入终止液50 μL，15 min内在450 nm波长测定各孔OD值；通过公式y=ax+b转换计算AngⅡ含量。

2.4.3 Western blot法检测左心室心肌组织内AT1R的蛋白表达 于冰箱中取出冻存的心脏组织，每组取3只老鼠，MinuteTM总蛋白提取试剂盒提取各组大鼠心脏组织蛋白，BCA蛋白定量测定试剂盒进行定量。80μg蛋白上样，经SDS-PAGE电泳及电转移PVDF膜后，5%脱脂奶粉37 ℃封闭1 h，一抗4 ℃过夜，TBST洗涤5次，5 min/次；HRP标记的二抗37 ℃孵育1 h，TBST洗涤5次，ECL检测试剂盒进行曝光。GAPDH作为内参对蛋白条带进行对比分析。

2.4.4 荧光定量PCR 法检测大鼠左心室心肌组织 PI3K、AKt的mRNA表达 于冰箱内取出心脏组织，每组取3只老鼠，Trizol法提取总RNA后逆转录为cDNA,设定反转条件：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，34 s，40个循环。表1显示，荧光定量PCR仪进行基因表达量检测，熔解反应按ABI 7500自动设定的条件进行，△△CT法对Real-time PCR结果进行定量分析。

2.5 统计学方法

表1 引物信息比较

3 结果

3.1 各组大鼠血压变化比较

表2显示，造模前后及治疗后各组大鼠血压变化比较。

表2 造模前后各组大鼠血压变化比较

注：与正常组比较:*P<0.05；与模型组比较:△P<0.05；与中药组比较:#P<0.05

3.2 各组大鼠左心室心肌组织AngⅡ、AT1R含量比较

表3图1显示，与正常组比较，模型组大鼠心肌组织AngⅡ及AT1R表达水平明显升高(P<0.01)；与模型组比较，中药组和西药组大鼠心肌组织AngⅡ、AT1R表达水平明显下降(P<0.01)，且西药组心肌组织AngⅡ、AT1R表达水平低于中药组(P<0.01)。

图1 各组大鼠左心室心肌组织AT1R含量比较

表3 各组大鼠左心室心肌组织AngⅡ、AT1R蛋白含量及PI3K、AKT mRNA含量比较

注：与正常组比较:*P<0.01；与模型组比较:△P<0.01；与中药组比较:#P<0.01

3.3 各组大鼠左心室心肌组织PI3K、AKt mRNA表达比较

表3显示，与正常组比较，模型组大鼠心肌组织PI3K、AKt的mRNA表达水平明显下降(P<0.01)；与模型组比较，中药组和西药组大鼠心肌组织PI3K、AKt的mRNA表达水平明显升高(P<0.01)，且西药组心肌组织AngⅡ表达水平高于中药组(P<0.01)。

4 讨论

伴随着生活节奏的加快，紧张、肥胖、高盐饮食等不良生活方式，使高血压成为严重危害人类健康的主要疾病之一，也是亚洲的高流行区域，经年龄调整的高血压患病率为20%～30%，且增长速率显著快于西方国家[12]。近年来，此病的发病率呈现逐年上升趋势。据统计，15岁以上人群的发病率约为11%，是冠心病、脑卒中等疾病的重要危险因素。研究证实，以高血压为原发病的各种心脑血管疾病已成为人类死因之首。高血压是一种多因素所致的疾病，与盐的摄入密切相关，且高盐摄入已成为高血压病的一个独立因素，Luft等率先提出盐敏感性高血压(SSH)的概念。大量流行病学和临床研究证实，钠盐摄入过多是原发性高血压发生发展的一个重要环境因素[13-17]。

RAAS作为调节血压和体液平衡的典型循环与内分泌系统，在盐敏感性高血压的发病中起重要作用[18-19]。AngⅡ促进血管收缩和肾上腺皮质分泌的醛固酮具有保钠排钾的作用，促进钠和水的重新收进而激活RAAS系统，引起血压增高。目前研究认为，高盐摄入引起的高血压会使强心类物质增加而抑制钠泵，最终导致血管平滑肌和心肌的收缩而引起高血压[20-21]。AngⅡ/AT1R信号通路与心肌纤维化和心肌细胞凋亡等心肌损伤密切相关，此通路的激活还是心肌肥大发生的机制之一。对于高血压来说，心肌肥大是对长期后负荷超载的血流动力学改变的一种适应性反应。研究证实，压力负荷和容量负荷所造成的机械应力增加是心肌肥大的始发因素，高血压大鼠存在心肌肥大的改变[22]。

PI3K/AKt是胰岛素调节细胞的主要信号通路，除了具有调控细胞生长、存活、凋亡等重要功能，还在心肌保护中占有重要地位。在信号分子水平上表现为AngⅡ/AT1R信号通路与PI3K/AKt信号通路之间存在串活7074。大量证据表明，原发性高血压由于RAS过度激活，打破了其与胰岛素信号之间串活的平衡，最终导致胰岛素信号通路失活的本质是RAS的主要效应因子AngⅡ表达上调后抑制了胰岛素信号通路PI3K/AKt的活性[6, 23]。

在本实验中，模型组大鼠AngⅡ、AT1R含量升高，PI3K、AKt mRNA下降，表明盐敏感高血压大鼠心肌组织的确有AngⅡ/AT1R信号通路的激活和PI3K/AKt信号通路的抑制。补阳还五汤可以显著下调AngⅡ、AT1R的含量，上调PI3K、AKt mRNA的表达，表明补阳还五汤可以抑制AngⅡ/AT1R信号通路的激活，缓解AngⅡ/AT1R与PI3K/AKt信号通路的失衡状态，降低血压，保护心肌组织的损伤，延缓高血压对靶器官的损伤。