调理脾胃针法对2型糖尿病前期大鼠降糖作用的研究❋

李 思，张智龙，杨元庆，周星娅，薛 莉，王 栩，邢晓彤

(天津市中医药研究院附属医院,天津 300120)

糖尿病前期是指血糖水平介于正常值与糖尿病诊断标准之间的一种糖代谢异常状态，此期是2型糖尿病的高危易患人群，也是导致心脑血管事件的主要危险因素之一，并且较多糖尿病前期患者易合并大血管、微血管病变，或合并肥胖、高血脂、高血压等其他代谢紊乱问题。在2010年的1项对98658名中国成年人的调查显示，约有50.1%的成年人处于糖尿病前期阶段[1]。而超重和肥胖亦是2型糖尿病的危险因素之一，有80%的2型糖尿病前期患者发病时仅存在肥胖，无其他明显症状[2]。而对该人群进行早期干预，可使2型糖尿病发病危险降低58%[3-4]。

课题组通过多年的临床实践总结出的“调理脾胃针法”，在治疗2型糖尿病方面有着较好的疗效。前期研究显示，针刺可改善2型糖尿病大鼠的糖代谢及胰岛素敏感性[5]，但对2型糖尿病前期的降糖疗效尚不明确。因此为提高慢性病防治效果，本研究以高糖高脂饲料诱导2型糖尿病前期肥胖大鼠模型，以调理脾胃针法为干预措施，探讨针刺的降糖作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选取由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供的健康雄性5～6周SPF级Wistar大鼠(动物许可证号SCXK—<军>2012-0004)40只，体质量160～180 g。动物房室温保持在(25±2)℃，相对湿度保持在(55±5)%，实验动物在实验期间自由获取食物和饮用水，实验过程中对动物饲养及处理遵循2006年科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》[6]。

1.1.2 饲料配方 普通饲料及高脂高糖饲料均由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心加工提供。高脂高糖饲料配方：原料包括普通饲料63.9%,蔗糖20%,猪油10%,蛋黄粉5%,胆固醇1%,猪胆汁酸钠0.1%,所有动物饲料保存于专用冰箱，4 ℃保存。

1.1.3 主要试剂与仪器 大鼠胰岛素(INS)ELLSA Kit(武汉华美生物公司，货号CSB-E05070r)；血糖试纸(美国雅培公司)；血糖仪(美国雅培公司)；电子称(深圳Meilen公司)；精密天平(日本YMC公司)；台式PH计(瑞士METTLER TOLEDO公司)；TDZ4-WS低速台式离心机(长沙湘仪公司)；温育箱(上海天呈公司)；酶标仪(美国BioTeK仪器公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 2型糖尿病前期大鼠模型制备方法 高糖高脂饲料饲养诱导动物模型复制方法[7]：健康雄性SPF级Wistar大鼠40只，大鼠适应性喂养3 d后，随机抽取10只大鼠作为正常对照组给予普通饲料喂养。实验组30只用于造模，给予高糖高脂饲料，投食量不限，所有大鼠自由饮水。每周称体质量、量身长、测肥胖指数，连续饲养12周。挑选体质量超出正常对照组20%的大鼠作为模型复制成功的大鼠。于成模后将造模组按随机数字表法分为针刺组、模型组、西药组各10只。正常对照组给予普通饲料，其余各组给予高糖高脂饲料喂养。

1.2.2 动物分组干预方法 针刺组采用“调理脾胃针法”进行针刺，取穴曲池、合谷、血海、足三里、丰隆、阴陵泉、地机、三阴交、太冲(以上穴位均取双侧)、中脘，具体腧穴定位参照林文注主编的《实验针灸学》[8]。

图1、2示，操作方法：将大鼠置于前期研究中自制的大鼠针刺服中[5]，以减少躁动。身着大鼠针刺服后，大鼠躁动基本消失，可同时多针刺、久留针及同时针刺腹部与四肢腧穴，并可多只同时行针刺操作，具有针刺可行性。而后穴位与针具常规消毒，选用中研太和0.25×25 mm针灸针进行针刺，每次留针30 min，不做手法，每日1次，连续针刺30 d。模型组采取同样方法抓取、穿衣，但不进行任何治疗。空白组不做任何干预。

图1 大鼠针刺服

图2 针刺示意图

西药组：盐酸二甲双胍片(格华止，中美上海施贵宝制药有限公司，规格0.5 g/片，国药准字H20023370)。参考文献并结合临床常用剂量，最终确定实验剂量为250 mg/kg，使用时以5%阿拉伯树胶水溶液配制成混悬液，浓度25 mg/ml。

1.2.3 造模前后一般情况观察 观察造模前后各组大鼠精神状态、毛色、进食量、饮水量、尿量、便质，并记录死亡情况。

1.2.4 体质量、空腹血糖(FBG)、餐后2 h血糖(P2BG)的测量 测量前各组大鼠禁食12 h，自由饮水。于干预前、针刺30 d末次治疗结束后用电子称称量体质量，而后采用尾静脉取血方式，用血糖仪测量FBG。其后根据动物体质量用40%葡萄糖溶液，按照2 g/kg的剂量[9]给予大鼠灌胃，并于灌胃后120 min采取尾静脉取血方式，用血糖仪测量P2BG。

1.2.5 空腹血清胰岛素(FINS)测量 测量前各组大鼠禁食12 h，自由饮水。于干预前、针刺30 d末次治疗结束后用乙醚麻醉，采用眼眶静脉窦采血法，取约2 ml血液，静置20 min后于4 ℃ 3000×g离心15 min，取上清液采用酶联免疫吸附测定法，应用大鼠胰岛素(INS)ELISA Kit测量FINS。

1.2.6 胰岛素敏感指数(ISI)测量 胰岛素敏感指数计算[9]：采用公式ISI=Ln(l/FINS×FBG)，其中(FINS：空腹血清胰岛素；FPG：空腹血糖)计算胰岛素敏感指数。

1.2.7 血脂、游离脂肪酸 (FFA) 提取血清，按试剂盒说明书要求测定TC、TU、LDL-C、HDL-C含量；采用放免法测定，试剂盒由上海生物制品研究所提供，游离脂肪酸 (FFA)测定试剂盒。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 一般情况观察

造模前各组大鼠反应灵敏，毛色光泽，体型健壮，便质质软成形。造模组大鼠造模后慵懒少动，毛色晦暗，体形肥胖，进食量、饮水量、尿量明显增多，便质溏稀。

2.2 各组大鼠干预前后体质量、血糖及胰岛素抵抗相关指标比较

表1显示，干预前组间经方差分析比较，成模后针刺组、西药组、模型组体质量、血糖及胰岛素抵抗相关指标比较差异无统计学意义(P>0.05)，与空白组比较体质量明显增加(P<0.05)，FBG、P2BG、FINS、ISI明显增高(P<0.01)。干预后，模型组与空白组比较，体质量下降(P<0.05)，FBG、P2BG、FINS、ISI明显增高(P<0.01)。针刺组、西药组与模型组比较，体质量明显升高，FBG、P2BG、FINS、ISI明显下降(P<0.01)。针刺组与西药组各指标比较差异无统计学意义(P>0.05)；组内比较，针刺组、西药组体质量较干预前明显增加(P<0.01)，模型组体质量较干预前明显减轻(P<0.01)。针刺组、西药组FBG、P2BG、FINS、ISI较前明显降低(P<0.01)，模型组FBG较前升高(P<0.05)，P2BG、FINS、ISI较前未见变化(P>0.05)，提示针刺治疗能有效改善糖尿病前期肥胖大鼠的FBG、P2BG、FINS、ISI，控制体质量，疗效与西药组相当。

表1 各组大鼠干预前后体质量、血糖及胰岛素抵抗相关指标比较

注：与空白组比较:*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较:∧∧P<0.01；与治疗前比较:▲P<0.05，▲▲P<0.01

2.3 干预后各组大鼠血脂及FFA比较

表2显示，干预后与空白组比较，模型组TC、TG、LDL-C、FFA水平均显著升高，HDL-C显著下降(P<0.01)，FFA变化不显著(P>0.05)；与模型组比较，针刺组大鼠TC、TG、LDL-C、FFA水平显著降低，HDL-C水平显著升高 (P<0.01)。而西药组上述指标亦较前明显改善，与针刺组比较差异无统计学意义(P>0.05)，提示针刺组改善糖尿病前期肥胖大鼠血脂及FFA水平，疗效与西药相当。

表2 干预后各组大鼠血脂及FFA变化比较

注：与空白组比较:**P<0.01；与模型组比较:△△P<0.01；与针刺组比较:▲▲P<0.01

3 讨论

美国糖尿病协会(american diabetes association，ADA)指出，糖尿病前期为血糖超过正常值，但尚未达到糖尿病诊断标准，包括空腹血糖受损(impaired fasting glucose，IFG)和葡萄糖耐量减退(impaired glucose tolerance，IGT)。其反映基础状态下及糖负荷后的血糖调节功能，并将二者合称为葡萄糖调节受损(impared glucose regulation，IGR)[10-11]。2013年中国糖尿病防治指南[4]亦指出，糖尿病前期表现为IFG和IGT，是由健康状态进展为糖尿病的一个特殊阶段。临床研究证实[12]，糖尿病前期患者就开始存在胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)、脂代谢紊乱等危险因素。为延缓这一过程，关键在于早期的积极干预，加强对此类人群的监测及管理，从而逆转IGR状态，减少糖尿病的发生。

课题组通过以长期高脂高糖饮食复制2型糖尿病前期肥胖大鼠模型，成模后的大鼠表现出慵懒少动，毛色晦暗，体形肥胖，进食量、饮水量、尿量明显增多、便质溏稀等症状。以上症状的出现，或可佐证课题组提出的“脾胃升降运化失常”是演变为消渴的病机关键。因脾胃同居中焦，水谷精微皆赖于脾胃升降运化。若久食肥甘，脾胃运化失常，膏脂留于肌腠则体胖；脾不散精上输于肺，肺无以输布则出现口渴多饮、体倦、毛发无光；脾不能为胃行其津，燥热内盛，出现消谷善饥；脾不能转输水谷精微，使其下流膀胱，出现尿多而甘。调理脾胃针法穴取曲池调胃肠气机，合谷升而能散,与曲池相伍通降肠胃,荡涤一切邪秽；中脘升清降浊，足三里健脾胃、助运化；阴陵泉健脾化湿，三阴交健脾益气、调和气血,与阴陵泉相伍健脾利湿；太冲平肝调肝；丰隆祛湿化痰；血海引血归脾、活血理血；地机善于活血化瘀，诸穴合用使升降有序、健运有常、气血得化、精微得布,脏腑百骸得以濡养。

本实验中由于饲喂高脂高糖饲料的缘故，导致造模的各组大鼠体质量、FBG、P2BG、FINS、ISI较空白组明显增高，提示模型组存在明显的IR，造模成功。分组干预30 d后，针刺组大鼠FBG、P2BG较模型组及干预前明显下降，且FINS水平与ISI均得到改善，提示针刺降糖是通过改善外周组织的IR实现的。而前期的实验研究显示，针刺可通过改善PI3K信号通路上下游关键蛋白IRS-1、IRS-2、GLUT-4，从而减轻IR，同时PI3K又为胰岛素信号传导的主要通路[13-15]。因此，笔者推论针刺可能通过PI3K通路促进胰岛素信号的下传，从而将葡萄糖更多地转运到细胞内，进而引起FBG、P2BG下降。又因胰岛素信号通路的改善，使FINS含量下降、INS降低。

与模型组比较，干预后针刺组大鼠TC、TG、LDL-C、FFA水平显著降低，HDL-C水平显著升高。FFA的代谢正常与否在2型糖尿病的发病过程中起非常重要的作用。FFA 水平增高既可增加IR，又可引起高胰岛素血症[16]。FFA通过葡萄糖-脂肪酸循环影响糖代谢，随着FFA浓度升高，脂肪酸氧化逐渐增加，抑制葡萄糖氧化和糖酵解，促使丙酮酸羧化酶活性增高，促进糖异生，使糖在细胞内堆积，从而抑制肌肉、肝脏等组织对葡萄糖的摄取和利用；同时可引起肝细胞对胰岛素的敏感性降低，使肝脏葡萄糖输出增多，血糖水平升高[17]，故本研究亦提示针刺可改善脂代谢及FFA水平。

因此本研究发现，调理脾胃针法能有效调节2型糖尿病前期大鼠的糖脂及胰岛素水平，增强其胰岛素的敏感性，降低血清中FFA水平，缓解 FFA 对外周葡萄糖利用的抑制作用，减轻胰岛素抵抗，从而为今后进一步的临床研究提供实验依据。