丁苯酞对阿尔茨海默病模型大鼠海马CA1区脑源性神经营养因子和碱性成纤维生长因子蛋白表达影响的实验研究*

邓春颖，李海滨，毛文静，李世英，刘 斌△

1．华北理工大学附属医院(唐山063000)；2.河北省遵化市人民医院(唐山063000)

阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)中枢神经系统慢性退行性疾病，多发于老年人，主要临床表现为记忆力下降、执行能力下降、人格及行为改变，严重时甚至会出现精神症状，严重影响患者的日常生活，给家庭和社会带来沉重的负担[1]。其发病机制尚不十分明确，较为公认的学说包括炎症与免疫学说、氧化应激学说、中枢胆碱能损伤学说等[2]。脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是一种广泛存在于海马和皮层的神经营养因子，其表达增加可影响AD模型大鼠学习记忆能力[3-4]。碱性成纤维生长因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)对神经元及神经胶质细胞等有神经营养作用[5]，其表达量对AD大鼠认知功能恢复有促进作用。丁苯酞(dl-3-N-butylphthalidle，NBP)是一种新药，目前主要应用于缺血性脑血管病，主要通过拮抗自由基、保护损伤的神经元起到脑保护作用。另有研究表明，NBP具有拮抗炎性反应、抑制神经元凋亡、保护受损的脑细胞等作用，主要通过对细胞内钙离子调节发挥作用的。本实验通过研究NBP对AD模型大鼠海马CA1区BDNF和bFGF蛋白表达，探讨NBP对AD模型大鼠脑保护作用的机制。

材料与方法

1 材 料

1.1 实验动物：选取72只2～3个月龄250～280 g健康清洁级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(北京华阜康生物科技有限公司)，合格证号为：SCXK[京]2014-0010。于华北理工大学屏障环境动物实验室喂养大鼠，室温、湿度适宜，12 h明暗交替光照，实验前适应喂养一周。

1.2 药物与试剂：丁苯酞软胶囊(国药准字H20050299，批号121101，0.1 g/粒)。一抗：兔抗大鼠BDNF多克隆抗体(购自北京博奥森生物公司)、兔抗大鼠bFGF抗体(购自北京博奥森生物公司)；兔二步法免疫组化试剂盒(北京中杉生物有限公司)；DAB 显色液(北京中杉生物有限公司)。DAB 显色液、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳低分子质量标准蛋白(北京中杉生物有限公司)。

1.3 主要仪器：石蜡组织切片机(德国LEICA公司)。透射电子镜(日本HITACHI公司)。脑立体定位仪(安徽淮北正华生物仪器设备有限公司)。Morris 水迷宫(淮北正华生物仪器设备有限公司)。电凝仪(张家港市航天医疗电器有限公司)。

2 研究方法

2.1 动物分组：实验大鼠随机分为假手术组(Sham)组、AD模型组(AD)组、丁苯酞治疗组(NBP)组，造模成功后，将上述各组随机分为造模后 1、2、4 和 8 周 4 个亚组。

2.2 模型制备：用无菌生理盐水处理Aβ1-42，制成浓度为1 μg/μl溶液，将其孵育达到凝聚状态。通过Morris水迷宫筛选实验动物，去除先天性痴呆及游泳姿势不良等大鼠。10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，应用脑立体定位仪定位，向AD组及治疗组大鼠双侧海马CA1区注入5 μl聚集态1 μg/μl Aβ溶液，然后缓慢撤出针头，用骨蜡封闭骨质创口，缝合切口皮肤，手术区用硫酸庆大霉素注射液消毒。Sham组注射5 μl生理盐水。

2.3 给药方法:NBP组将NBP与食用油混合后制成的NBP混合溶液进行灌胃(浓度8 mg/ml，剂量1 ml/100 g)，每日2次；Sham组和AD组采用同等剂量的食用油进行灌胃，对各组大鼠进行灌胃处理，每日2次，分别连续给药1、2、4、8周。

2.4 行为学测试:采用Morris水迷宫实验测试实验造模成功给药后大鼠的学习记忆能力[3]。采用水迷宫实验分别观察各组大鼠灌胃后1周、2周、4周和8周穿越平台的次数。

2.5 免疫组织化学检测:腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉大鼠后，快速灌注0.9%氯化钠溶液，排出血管内血渍、肝脏变白后，滴注4%多聚甲醛至大鼠全身肌肉僵硬，断头取脑，并剥离脑组织，4%多聚甲醛-PBS固定过夜后石蜡包埋含海马的脑组织切片备用。取组织标本，加入羊血清封闭液，滴加一抗，20 μl抗BDNF蛋白(1∶300)、抗bFGF蛋白(1∶200)4℃过夜，滴加二抗孵育1 h，进行DAB显色。具体操作步骤按试剂说明书操作要求进行。BDNF、bFGF免疫组织化学阳性标准，细胞胞浆和胞核呈棕褐色。应用OLYMPUS摄像显微镜(400×)对组织切片采集图像，随机观察各组大鼠海马CA1区不重叠的6个视野，应用 Motic Med 6.0 数码医学图像分析系统。

2.6 Western blot检测:各组实验大鼠喂养至各个时相点后，麻醉、断头、取脑组织，加入组织裂解液后研磨裂解40 min，离心后将清液置于-80℃冰箱保存备用。将蛋白定量、分装，调蛋白浓度至800 μg/ml，加等体积的上样缓冲液，置于沸水中煮5 min。冷却后放入4℃冰箱备用。

检测方法：取等量蛋白样品(50 μg)置于10% SDS聚丙烯酸铵凝胶电泳，以湿转法电转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上，室温封闭2 h。分别加入一抗，抗BDNF蛋白(1∶500)、抗bFGF蛋白(1∶400)，4℃冰箱过夜，次日漂洗后加羊抗兔二抗(1∶2000)，于37℃环境反应2 h，PBS洗膜后加BCIP/NBT显色数分钟，双蒸馏水终止显色，Image J软件进行灰度值测定分析。

结 果

1 各组大鼠学习记忆能力的检测结果 与Sham组比较，AD组大鼠穿越平台次数明显减少(P<0.01)；与AD组比较，NBP组大鼠穿越平台次数增加(P<0.01)。见表1。

2 各组大鼠海马CA1区BDNF检测结果

2.1 免疫组化法结果:BDNF蛋白在Sham组大鼠各时间点海马CA1区均可见少量表达。在AD组大鼠各时间点表达增多，1周时有多量表达，2周时表达继续增多，4周时表达量最高，8周时稍有下降但仍处于较高水平。与Sham组相比，BDNF蛋白在AD组大鼠各时间点表达增多，差异有统计学意义(P<0.01)；与AD组比较，BDNF蛋白在NBP组大鼠各时间点表达明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2、图1。

表1各组大鼠穿越平台次数(次)

注：与Sham组比较，*P<0.01；与AD组比较，#P<0.01

表2各组大鼠海马 CA1 区 BDNF 免疫组化结果(个/高倍视野)

注：与Sham组比较，*P<0.01；与AD组比较，#P<0.01

注：A为Sham组；B为AD组；C为NBP组；1、2、3、4 分别为1、2、4、8周

2.2 Western blot检测结果:BDNF蛋白在假手术组大鼠各时间点海马CA1区有少量表达。与假手术组相比，BDNF蛋白在AD模型组各时间点表达明显增多，差异有统计学意义(P<0.01)，4周时达高峰。与AD模型组比较，BDNF蛋白在NBP治疗组各时间点表达明显减少，差异有统计学意义(P<0.01)。见表3、图2。

表3各组大鼠海马 CA1 区BDNF Western blot结果

注：与Sham组比较，*P<0.01；与AD组比较，#P<0.01

图2 各组大鼠海马CA1区BDNF Western blot结果

3 各组大鼠海马CA1区bFGF检测结果

3.1 免疫组化法结果：bFGF蛋白在Sham组大鼠各时间点海马CA1区均可见少量表达。在AD组大鼠各时间点表达增多，1周时有多量表达，2周时表达继续增多，4周时表达量最高，8周时稍有下降但仍处于较高水平。与Sham组相比，bFGF蛋白在AD组大鼠各时间点表达增多，差异有统计学意义(P<0.01)；与AD组比较，bFGF蛋白在NBP组大鼠各时间点表达明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)。见表4、图3。

表4各组大鼠海马 CA1 区 bFGF 免疫组化结果(个/高倍视野)

注：与Sham组比较，*P<0.01；与AD组比较，#P<0.01

注：A为Sham组；B为AD组；C为NBP组；1、2、3、4 分别为1、2、4、8周

3.2 Western blot检测结果:bFGF蛋白在假手术组大鼠各时间点海马CA1区有少量表达。与假手术组相比，bFGF蛋白在AD模型组各时间点表达明显增多(P<0.01)，4周时达高峰。与AD模型组比较，bFGF蛋白在NBP治疗组各时间点表达明显减少，差异有统计学意义(P<0.01)。见表5、图4。

表5各组大鼠海马 CA1 区bFGF Western blot结果

注：与Sham组比较，*P<0.01；与AD组比较，#P<0.01

图4 各组大鼠海马CA1区bFGF Western blot结果

讨 论

AD是全世界最普遍的痴呆症，多发生于中年或老年的早期，病初有轻度认知功能障碍，随着病情进展，发展为严重的不可逆的神经变性、认知功能退化、精神行为异常。目前治疗AD公认的有效药物包括多奈哌齐、美金刚、加兰他敏、卡巴拉汀等，本文为AD治疗发现新的药物。NBP是从芹菜种籽内分离得到，呈黄色油状液体，是我国自主研发的拥有知识产权的新药。它具有改善脑部微循环、保护线粒体等作用，近年来研究表明NBP还具有神经保护、促进认知功能恢复、抑制Aβ沉积、抗炎等[6-9]作用。本研究测试了实验大鼠的学习记忆能力，与AD组比较，NBP组大鼠穿越平台次数增加，表明NBP能改善AD大鼠的学习记忆能力，并且研究其可能机制。

BDNF是1982年Barde等在猪脑中发现的一种具有神经营养作用的蛋白质，广泛存在于神经系统中，尤其是中枢神经系统，海马和皮质表达量最高，对神经元的分化、生长有重要作用[10]。BDNF 可通过多种途径保护受损细胞，促进神经功能恢复。无论在体内或体外条件下，BDNF均能促进胆碱能神经元的分化和存活。BDNF通过调节突触可塑性、促进神经发生尤其是海马的神经发生，改善已经破坏受损的学习及记忆能力，BDNF增加可改善AD大鼠的学习记忆能力[11-12]。本实验结果显示，AD大鼠海马CA1区BDNF高于Sham组，当神经功能缺失、神经细胞退化，可刺激脑组织内BDNF表达，保护神经功能、修复神经元。给予NBP治疗后的大鼠，脑组织海马CA1区BDNP表达量进一步增多，明显高于AD组，证明NBP能明显增加AD大鼠脑组织内的BDNF表达，同时大鼠学习记忆能力也得到改善。Lv等[13]研究表明，NBP能改善快速老化鼠学习记忆能力，并能上调BDNF表达，与本实验结果一致。

bFGF是1940年在脑和垂体发现的一种能够促进成纤维细胞生长的物质，是含有155个氨基酸的多肽生长因子，能提高神经元的存活、诱导轴突向外生成，能促进神经干细胞增殖、抑制分化[14-18]。bFGF能对抗多种损伤，如缺血、低血糖、自由基等，故而起到对神经元的保护作用。在大鼠学习记忆和锻炼过程中bFGF mRNA水平上升。本研究结果显示，AD大鼠海马CA1区bFGF高于Sham组，当神经功能缺失、神经细胞退化，可刺激脑组织内bFGF表达，保护神经功能、修复神经元。给予NBP治疗后的大鼠，脑组织海马CA1区bFGF表达量进一步增多，明显高于AD组，证明NBP能明显增加AD大鼠脑组织内的bFGF表达，而且大鼠学习记忆能力也得到改善。

综上研究显示，NBP改善AD模型大鼠的学习记忆能力，可能是通过上调BDNF和bFGF的表达而实现的，为AD治疗提供新思路。