猫传染性腹膜炎病毒AH1905株N基因的生物信息学分析及原核表达

王元红，邢 雪，李传峰，朱 杰，王 勇，刘光清，*

(1.安徽农业大学 动物科技学院，安徽 合肥 230036； 2.中国农业科学院 上海兽医研究所，上海 200241)

猫冠状病毒(Feline coronavirus，FCoV)为不分节段单股正链RNA病毒，属于尼多病毒目冠状病毒科冠状病毒属[1]。基于病毒中和抗体反应和S基因氨基酸序列的不同，FCoV分FCoV-Ⅰ和FCoV-Ⅱ型2个均可导致猫传染性腹膜炎病毒(feline infectious peritonitis，FIP)的基因型[2]。其中，FCoV-Ⅰ型毒株感染率高达80%～95%，而FCoV-Ⅱ型毒株感染率只占5%～20%[3]。携带FIPV病毒的猫可通过粪便排毒传染同居的猫，也可经衣服、食皿、寝具、人或昆虫等途径传播[4]。不同年龄的猫均可感染，老龄猫和1周岁以内的猫发病率高，且纯种猫发病率高于一般品种的家猫[5]，严重危害宠物业及养殖业的健康发展。

1963年，Holzworth在美国首次报道FIP。随着宠物行业飞速发展，世界各地猫群交流日渐频繁，FCoV现已广泛分布于世界猫群中[6]。FCoV基因组全长约为30 kb，编码4种与病毒粒子入侵相关的保守膜相关蛋白：刺突糖蛋白(S)、小包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)[7]。冠状病毒N基因相对保守，可作为核酸检测、血清学检测和流行病学研究的良好靶点[8]。目前国外关于FIPV的研究多集中在鉴别诊断和致病机理上，而关于FIPV在国内的流行情况、早期诊断，及相应生物制品研发的相关报道均很少见[9-10]。本研究拟对本实验室分离获得的FIPV AH1905进行研究，克隆其N基因并进行分析，通过生物信息学软件预测分析N基因编码蛋白的结构与抗原表位，并在大肠埃希菌原核表达系统中表达重组蛋白，制备鼠源多克隆抗体，为FIPV在中国的流行状况提供参考数据，同时也为进一步开展FIPV的分子生物学研究奠定物质基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料和试验动物

FIPV AH1905株、pGEX-4T-1载体由本实验室保存。pMDTM19-T载体购自TaKaRa公司。6周龄SPF级Balb/c小鼠购自上海杰思捷实验动物有限公司，许可证号码为SCXK(沪)2018-0004。

1.2 主要试剂

UNlQ-10柱式总RNA抽提试剂盒、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；M-MLV Reverse Transcriptase试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司；SolutionⅠ、限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ，购自宝生物工程(大连)有限公司；DH5α和Rosseta感受态细胞，购自北京全式金生物技术有限公司；2×Phanta Max Master Mix，购自南京诺唯赞生物科技有限公司；PBS缓冲液、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、ECL试剂盒，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；抗His标签的鼠源一抗、HRP标签的羊抗鼠IgG，购自北京中杉金桥生物技术有限公司；弗氏佐剂，购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 引物设计与合成

根据已发表的FIPV 79-1146株基因序列(No. DQ010921)，设计N基因特异性引物：上游，5′-CAGGATCCATGGCCACACAGGGACAACG-3′(下划线处为BamHⅠ酶切位点)；下游，5′-CGGAATTCTTAGTTCGTAACCTCATCAATCATCTCAACCTGTGTGTC-3′(下划线处为EcoRⅠ酶切位点)。引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3.2N基因的分子克隆

按UNlQ-10柱式总RNA抽提试剂盒说明书提取FIPV野毒株RNA。取10 μL提取的RNA于50 μL反应体系进行RT-PCR反应，获取cDNA，保存于-80 ℃待用。

PCR反应体系(50 μL)：2 × Phanta Max Master Mix 25 μL、ddH2O 20 μL、DNA模板1 μL，上下游引物各2 μL。PCR条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环；72 ℃再延伸5 min。PCR产物回收后克隆至pMDTM19-T载体，转化DH5α感受态细胞，涂布至氨苄抗性的固体培养基，隔天挑取阳性克隆提取质粒，命名为pMDTM19-T-N，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.3.3N基因的序列分析

用DNASTAR软件将分离毒株的N基因序列分别与GenBank中已发表的FIPV国内外代表株进行核苷酸同源性比较。

1.3.4N基因编码蛋白的生物信息学分析

采用ProtparamSOPMA在线程序分析FIPV HF1905株N蛋白的理化性质；利用SOPMA在线程序分析二级结构；利用SingalP5.0在线程序预测信号肽；利用TMHMM2.0 Server在线程序预测跨膜结构域；利用NetPhos3.1 Server在线程序预测磷酸化位点；利用DNAStar的Protean程序预测B细胞表位；利用nHLAPred的ComPred在线服务器预测CTL表位；利用ProPred在线服务器预测Th表位。

1.3.5 重组载体pGEX-N构建

将pMDTM19-T-N与pGEX-4T-1空载体质粒经内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后连接，转化，对阳性克隆菌液PCR扩增、双酶切鉴定，将测序正确的重组质粒命名为pGEX-N。

1.3.6 重组质粒的诱导表达和蛋白纯化

将pGEX-N与pGEX-4T-1空载体质粒分别转化Rosetta感受态细胞，接种至氨苄抗性的固体培养基，分别挑取单菌落至LB液体培养基。37 ℃恒温摇床振荡培养至D600值在0.6～0.8时，加入0.5 mmoL·L-1的IPTG，于37 ℃、220 r·min-1诱导表达，取5 μL样品SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色。对诱导成功的重组菌进行大量诱导，4 ℃离心收集样品，于冰浴下超声裂解，分别收集上清和沉淀分析重组蛋白的可溶性。采用常规包涵体洗涤、尿素复性及蔗糖浓缩方法[11]对重组蛋白进行纯化。

1.3.7 Western blot检测

将纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳后，转膜，5%脱脂奶粉4 ℃封闭过夜，TBST漂洗3次后加入1∶1 000稀释的抗GST标签的鼠源单抗，37 ℃孵育1 h。TBST漂洗3次后加入1∶1 000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37 ℃孵育1 h后TBST漂洗3次。利用ECL发光试剂盒显色。

1.3.8 鼠源N蛋白多克隆抗体的制备

以纯化的重组N蛋白免疫6周龄BALB/c雌鼠。免疫程序参照文献[12]进行。第4次免疫后1周，从眼眶采血分离获得多克隆抗体。对已诱导的重组蛋白和pGEX-4P-1对照菌蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜，以制备的多抗血清为一抗、HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗，进行Western-blot分析。

2 结果与分析

2.1 N基因扩增

经RT-PCR扩增出的N基因约1 134 bp，与预期结果相符。测序分析结果表明，与参考毒株序列相比，未发生碱基突变或缺失现象(图1)。

2.2 N基因的序列比对分析

AH1905株的N基因长为1 134 bp，序列比对分析表明：AH1905株与各代表株核苷酸同源性为90.2%～92.4%，氨基酸同源性为91.8%～93.9%。其中，分离株与荷兰的UU34株核苷酸同源性(92.4%)和氨基酸同源性(93.9%)最高(表1)。绘制的系统进化树结果表明，本试验分离出的AH1905株与其他FIPV基因Ⅰ型代表株处于同一遗传进化分支，并与同一小分支的UU34/UG-FH8/UU30株亲缘关系最近。而AH1905株与FCoV-Ⅱ型经典代表株79-1146亲缘关系较远，这与核苷酸同源性(91.1%)和 氨基酸同源性(92.9%)的分析结果一致(图2)。

M，DNA 分子质量标准；1，阴性对照；2，N基因RT-PCR结果。M， DNA molecular weight standards; 1， Negative control; 2， N gene RT-PCR results.

2.3 理化性质分析

利用Protparam在线程序分析该毒株N蛋白的理化性质，结果显示，该蛋白由377个氨基酸组成，分子式为C1868H2921N565O585S6，相对分子质量为42 846.54，理论pI(等电点)值为9.73，不稳定系数为38.95，平均亲水值(GRAVY)为-1.009，为亲水性稳定蛋白蛋白质，带负电荷的氨基酸(Asp+Glu)为44个，带正电荷的氨基酸(Arg+Lys)为62个，脂肪族系数为53.53。

表1 分离株N基因与不同FIPV参考株的序列同源性分析

Table1analysis ofNgene sequence homology between isolated strains and different FIPV reference strains

参考株名称Strain登录号GenBankaccessionNo.N基因核苷酸同源性Nucleotidesequencehomology/%N基因氨基酸同源性Amino acidsequencehomology/%DF-2 R3iJQ40898091.193.1UG-FH8KX72252992.392.3 UU9FJ93806292.292.1UU10FJ93805990.292.3UU11FJ93805290.291.8UU30HQ39247291.492.3UU34HQ01237292.493.9UU54JN18388390.692.179-1146DQ01092191.192.9DF-2DQ28638991.192.9HLJ/HRB/2016/10KY56620992.092.3HLJ/DQ/2016KY58733792.291.8XXNMN16510791.592.6BJ/2016/01KY56620590.791.8

●表示本试验分离毒株。●represented the strains isolated in this study.

2.4 二级结构分析

利用SOPMA在线程序预测N蛋白的二级结构，结果显示，该蛋白的二级结构包括α螺旋(h，14.06%)、延伸链(e，15.12%)、β转角(t，3.71%)、无规则螺旋(c，67.11%)4种类型。

2.5 信号肽、跨膜结构域、磷酸化位点的预测分析

分别利用SingalP5.0和TMHMM2.0 Server在线程序预测该蛋白的信号肽和跨膜结构域。结果显示，N蛋白无信号肽区域和跨膜结构域。利用NetPhos3.1 Server在线程序预测N蛋白的磷酸化位点，结果显示，该蛋白共有48个潜在的磷酸化位点，其中，丝氨酸位点30个，苏氨酸位点16个，酪氨酸位点2个。

2.6 B细胞抗原表位的预测分析

利用DNAStar的Protean程序预测N蛋白的B细胞抗原表位(图3、表2)。结合该蛋白的二级结构、亲水性、柔韧性、抗原性和表面可及性进行综合分析，该蛋白第62～67、81～86、160～167、172～190、313～318、331～340处可能存在优势抗原表位。

2.7 T细胞表位的预测分析

2.7.1 CTL表位预测

利用nHLAPred的ComPred在线服务器，将阈值调节为0.5，分别预测HLA-A2、HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203和HLA-A*0205共5种分子的结合肽(表3)，结果显示，第1～9位的MATQGQRVS和276～280位的CVPSV可能存在N蛋白的CTL表位。

2.7.2 Th表位预测分析

利用ProPred在线服务器分别预测DRB1-0101、DRB1-0102、DRB1-0301的Th表位(表4)，结果显示，第47～55位的FWNLCPRDF和76～84位的FRIVKGQRK可能存在N蛋白的Th表位。

2.8 重组蛋白的SDS-PAGE分析

图3 FIPV N蛋白的B细胞表位预测Fig.3 Prediction of B cell epitopes of FIPV N protein

表2FIPVN蛋白中B细胞抗原表位的位置预测

Table2Prediction of location of B cell epitopes in FIPV N protein

方法Method位置Position二级结构Secondary structure3～6,15～18,22～29,42～45,51～54,56～59,62～80,81～103,109～119,123～126,131～134,141～144,148～157,160～167,172～204,208～211,215～218,220～223,227～230,238～241,244～247,252～255,257～260,263～266,271～307,309～310,313～326,331～340,351～364,369～377亲水性Hydrophilicity1～34,38～42,44～89,98～110,118～191,201～248,250～256,260～262,266～269,271～272,288～301,305～352,362～370,374～377,303柔韧性Flexibility5～8,12～31,40～45,52～67,80～86,96～110,122～147,153～190,202～230,233～243,249～251,255～260,263～265,279～281,286～290,292～299,309～318,327～351,364～367,199,362,374抗原性Antigenicity2～10,12～32,40～48,51～67,69～70,74～75,77～88,96～110,116～147,151～190,200～242,246～260,264～266,286～299,307～318,323～353,363～377表面可及性Surface probality1～377综合分析Parameter analysis62～67,81～86,160～167,172～190,313～318,331～340

表3FIPVN蛋白的CTL细胞表位预测

Table3Prediction of CTL cell epitopes in FIPV N protein

等位片段Allele顺序Rank起始位置Start position序列SequenceHLA-A211MATQGQRVS2265NAAQCYPQL3272QLAECVPSVHLA-A∗0201132PLSFYNPIT2269CYPQLAECV3272QLAECVPSV4283VLFGSQWSAHLA-A∗020211MATQGQRVS22ATQGQRVSW3355TLVEAYTDV

续表3 Continued Table 3

将鉴定正确的pGEX-N质粒转化至大肠埃希菌Rosetta细胞内，成功表达出相对分子质量约为68 ku的重组蛋白，SDS-PAGE检测结果显示，表达的蛋白主要以包涵体存在于菌体沉淀中(图4)。

表4FIPVN蛋白的Th细胞表位预测

Table4Prediction Th cell epitopes in FIPV N Protein

DRB1-0101顺序Rank起始位置Start Position序列SequenceDRB1-0102顺序Rank起始位置Start Position序列SequenceDRB1-0103顺序Rank起始位置Start Position序列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

M，蛋白分子质量标准；1，未经诱导的PGEX-4T-1质粒；2，经诱导的PGEX-4T-1质粒；3，诱导表达的重组N蛋白(细菌沉淀)；4，诱导表达的重组N蛋白(细菌上清)。M， Protein molecular weight standards; 1， pGEX-4T-1 was not induced; 2， pGEX-4T-1 was induced; 3， The recombinant plasmid pGEX-N induced expression (E. coli precipitate); 4， pGEX-N induced expression (E. coli supernatant).

2.9 Western blot鉴定结果

利用Western blot对蛋白进行进一步分析，结果显示，在硝酸纤维素膜上约68 ku处有一特异性条带，表明重组蛋白能成功被抗GST标签的一抗识别，具有良好的反应原性(图5-A)。纯化蛋白以鼠源抗N阳性血清为一抗、HRP标签的羊抗鼠IgG为二抗进行Western blot鉴定，结果显示，重组蛋白能够被抗N阳性血清特异性识别(图5-B)。

M，蛋白分子质量标准；1，诱导表达的重组N蛋白；2，诱导的pGEX-4T-1质粒；3，诱导表达的重组N蛋白；4，诱导的pGEX-4T-1质粒。M， Protein molecular weight standards; 1， The recombinant plasmid pGEX-N was induced; 2， The plasmid pGEX-4T-1 was induced; 3， The recombinant plasmid pGEX-N was induced; 4， The plasmid pGEX-4T-1 was induced.

3 讨论

2019年5月，安徽省合肥市某动物医院有一6月龄病猫腹围异常增大，腹腔充斥淡黄色黏稠积液，血常规检查显示白蛋白升高，治疗无效后死亡。经畜主同意剖检后，可见患猫体内大部分脏器的浆膜层出现纤维蛋白性沉积及肉芽型水肿，初步判定为FIP。为进一步确诊病原，本试验采集肝脏病料，利用RT-PCR方法扩增疑似FIPV的N基因并进行序列比对分析。RT-PCR扩增结果显示，成功扩增出与预期大小相符的目的基因条带，证实该猫携带FIPV病原。

自2003年灵猫科动物果子狸将“非典”(SARS)传播至全球之后，人们对冠状病毒的研究越来越重视[13]。FIPV作为同属α-冠状病毒属的重要成员，其引发的FIP在感染早期无特征性症状，出现临床症状后病畜多以死亡结束转归[14]，因此FIP的早期诊断和疫苗研发尤为重要。目前，国内外的主要研究方向主要集中在FIPV的鉴别诊断上，而对于FIP的流行病学调查和相关生物制品的研发较少[15-17]。众所周知，冠状病毒的侵袭依靠多种蛋白的协同作用。N蛋白作为FIPV的核蛋白保护病毒RNA基因组，介导病原体的转运及出芽，与病毒的增殖息息相关[18]。因此，本研究以最近分离的FIPV AH1905株为模板成功克隆出N基因，经核苷酸序列比对发现与2010年荷兰分离株UU34株的核苷酸(92.4%)和氨基酸(93.9%)同源性较高，而与FIPV经典株79-1146的核苷酸(91.1%)和氨基酸(92.9%)同源性较低。绘制的遗传进化树表明，AH1905株与国内主流毒株在同一分支，属FIPV基因Ⅰ型，但与国外的UU34、UG-FH8、UU30亲缘关系较近，而与国内流行的XXN、HLJ/HRB/2016/10及HLJ/DQ/2016亲缘关系较远。合肥地区FIPV的基因型与国内外参考毒株遗传进化存在较大差异；因此，应尽快对我国猫群进行调查分析，了解不同地区FIPV的流行情况，为我国FIPV的分子流行病学调查提供信息。

对该基因编码的蛋白进行生物信息学分析，预测N蛋白为亲水稳定蛋白，无信号肽结构。无信号肽结构的蛋白更易形成包涵体[19]，这与SDS-PAGE检测结果相一致。N蛋白不存在跨膜结构域，有48个潜在磷酸化位点，其二级结构内无规则卷曲和α螺旋结构较多，β折叠较少。β折叠和无规则卷曲区域的二级结构比较松散，稳定性差，更易于盘旋和扭曲，容易与抗体分子结合[20]，结合亲水性、柔韧性、抗原性、表面可及性等参数分析，在第62～67、81～86、160～167、172～190、313～318、331～340处可能存在B细胞优势抗原表位，同时在第1～9、276～280位存在潜在CTL优势表位，在第47～55位和76～84位存在潜在Th优势表位，提示N蛋白具有良好的抗原特性，具有作为理想的抗原识别区域和亚单位疫苗的潜力。进一步对N基因进行原核表达，构建pGEX-N重组质粒，经诱导表达可见大小约68 ku的蛋白主要以包涵体形式存在。Western blot结果显示，该蛋白能与鼠源抗FIPV血清发生特异性免疫反应，表明FIPV N蛋白具有良好的特异性和抗原性，进一步证明N蛋白可以作为检测抗原的靶标。

总之，本研究首次对安徽合肥地区的FIPVN基因进行序列分析，可为FIPV的流行病学研究提供一定的参考。通过生物信息学方法对FIPV N蛋白进行生物信息学分析，初步预测了N蛋白的结构和功能、潜在的B细胞抗原表位，以及HLA抗原肽和MHC抗原肽。同时制备了FIPV N蛋白和鼠源多克隆抗体等珍贵的生物材料，为下一步深入研究该蛋白的结构与功能奠定了基础，同时也为日后FIP的早期诊断和亚单位疫苗的研究提供了物质基础。