蛋用鹌鹑IGF-1R基因的多态性与体尺性状相关性分析

白俊艳，卢军浩，付学言，武晓红，杨又兵，雷 莹，庞有志，*，卢小宁，巩慧荣，胡陆星，刘红涛，樊红灯，曹 恒，时坤鹏，陈梦柯，马永康

(1.河南科技大学 动物科技学院，河南 洛阳 471023； 2.洛阳市动物遗传育种重点实验室，河南 洛阳 471023； 3.甘肃农业大学 动物科学技术学院，甘肃 兰州 730070)

类胰岛素生长因子1型受体(IGF-1R)基因是类胰岛素生长因子IGFs在生物机体内体现功能作用的主要效应器，不仅能够调控IGFs在体内的活力，而且对细胞自身成长周期的调控、代谢、增殖分化、免疫调节和成年期的重要过程均有调控作用[1]。赵秀华等[2]研究表明，IGF-1R基因的BB基因型对4周龄的京海黄鸡的体质量有显著影响(P<0.05)。吕莉等[3]研究表明，IGF-1R和IGF-2R基因在鸭腹部脂肪中都表现出一定的规律，普遍为先升高后下降，IGF-1R基因在鸭皮下脂肪中的mRNA表达规律呈现出波浪式变化。Szewczuk[4]研究表明，IGF基因对蒙特利尔奶牛犊牛的平均体质量有极显著影响(P<0.01)。Guo等[5]研究表明，IGF-1Ra和IGF-1Rb基因对石斑鱼的眼球直径有着显著影响(P<0.05)。可见，IGF基因在动物体生长发育过程中有着极为重要的作用。

鹌鹑依照其用处，分为蛋用鹌鹑、肉用鹌鹑和试验用鹌鹑等[6]。鹌鹑体型较小，繁殖周期较短，对光刺激等实验条件比较敏感，且饲养管理方便，是用作科学实验的理想生物[7]。鹌鹑也有娱乐价值，可以被用来参观和斗鹑[8]。我国特禽的规模化养殖起步较晚。20世纪70年代末，我国开始引进国外优良特禽品种，在各地进行大规模繁育工作，由此拉开了我国培育优良鹌鹑品种的序幕[9]。本研究利用PCR产物直接测序等方法对IGF-1R基因在3个蛋用鹌鹑群体中进行多态性分析，并分析了IGF-1R基因与鹌鹑体尺性状的相关性，旨在为蛋用鹌鹑的标记辅助选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料和性能测定

中国黄羽鹌鹑46只、中国白羽鹌鹑49只、朝鲜鹌鹑48只，全部为母鹌鹑。每个鹌鹑活体翅下采集1 mL血液，利用禽类全血基因组DNA提取试剂盒(郑州鼎国生物有限公司提供)提取DNA。在第9周龄时测定鹌鹑的体尺性状，包括体质量、胫长、胸宽、胸深、体长、胸骨长和胫围，具体测量方法见文献[10]。

1.2 IGF-1R的引物信息

IGF-1R基因的引物序列来自吴鹏飞等[11]，引物具体信息如下：F，5′-AACGCCTGGAGAACTGTACG-3′；R，5′-ATCGCTGAGGCTTTCCAAG-3′。片段大小155 bp，退火温度56 ℃。

1.3 PCR扩增

PCR扩增反应体系的总体积为15 μL，具体为去离子水5.3 μL，上游引物0.6 μL，下游引物0.6 μL，DNA为1 μL，2×TaqPCR Mix为7.5 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34个循环；72 ℃后延伸7 min；4 ℃保存。

1.4 测序与数据分析

把鹌鹑所有个体的PCR产物直接送往擎科测序公司进行测序，测序结果利用Chromas软件分析突变位点，利用SPSS等软件进行IGF-1R的多态性与体尺性状的相关性分析。分析模型：Yij=μ+Mi+eij，其中，Yij为性能观测值，μ为总体均值，Mi为第i个基因型效应，eij为随机误差。

2 结果与分析

2.1 鹌鹑IGF-1R基因的PCR扩增结果

鹌鹑IGF-1R基因的PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1。从图1可以看出，PCR产物为一条明亮的单带，PCR产物大小约为155 bp，是目的基因。

2.2 鹌鹑IGF-1R基因的测序分析

鹌鹑IGF-1R基因测序后发现，在57 bp和72 bp检测到2个突变位点，具体突变情况见图2和图3。IGF-1R基因在A57G位点为A/G突变，可以检测到AA、AG、GG三种基因型；在A72T位点为A/T突变，可以检测到AA、AT、TT三种基因型。

M，Marker DL 2000；1～2，中国黄羽鹌鹑；3～4，北京白羽鹌鹑；5，朝鲜鹌鹑。M， Marker DL 2000; 1-2， Chinese yellow quail; 3-4， Beijing white quail; 5， Korean quail.

2.3 鹌鹑IGF-1R基因的群体遗传学分析

IGF-1R基因A57G位点和A72T位点的基因型频率和基因频率见表1。由表1可知，A57G位点在中国黄羽鹌鹑和朝鲜鹌鹑中，AA基因型频率最低，分别为0.022和0.021，GG基因型频率最高，分别为0.782和0.604，因此GG基因型为中国黄羽鹌鹑和朝鲜鹌鹑的优势基因型，在中国黄羽鹌鹑和朝鲜鹌鹑中G等位基因的频率分别为0.880和0.791。在北京白羽鹌鹑中，A57G位点的AG基因型频率最高，为0.653，AG基因型为优势基因型，G等位基因的频率最高，为0.510。

A72T位点在中国黄羽鹌鹑、北京白羽鹌鹑和朝鲜鹌鹑3个鹌鹑群体中，AA基因型的频率分别为0.304、0.143和0.188，AT基因型的频率分别为0.435、0.735、0.479，TT基因型的频率分别为0.261、0.122和0.333，因此AT基因型为该位点的优势基因型。中国黄羽鹌鹑和北京白羽鹌鹑中，A72T位点的A等位基因频率最高，分别为0.522和0.511，而在朝鲜鹌鹑群体中T等位基因频率最高，为0.572。

图2 A57G位点的突变位点检测Fig.2 Detection of mutation sites at A57G locus

图3 A72T位点的突变位点检测Fig.3 Detection of mutation sites at A72T locus

表1A57G和A72T突变位点等位基因频率和基因型频率的比较

Table1Comparison of allele and genotype frequencies of A57G and A72T mutation sites

位点Loci中国黄羽鹌鹑China yellowquail北京白羽鹌鹑Beijing whitequail朝鲜鹌鹑Korean quailA57GAA0.0220.1630.021AG0.1960.6530.375GG0.7820.1840.604A0.1200.4900.209G0.8800.5100.791A72TAA0.3040.1430.188 AT0.4350.7350.479TT0.2610.1220.333A0.5220.5110.428T0.4780.4890.572

2.4 IGF-1R基因的多态性与鹌鹑第9周龄体尺性状的相关性分析

鹌鹑IGF基因的多态性与鹌鹑第9周龄体尺性状的相关性分析结果见表2和表3。由表2可知，A57G位点对中国黄羽鹌鹑的胫长、胸骨长、胫围有显著影响(P<0.05)，具体表现为：A57G位点AA基因型的胫长和胸骨长显著(P<0.05)高于AG基因型和GG基因型；AA基因型的胫围显著(P<0.05)高于GG基因型。A57G位点对北京白羽鹌鹑的胫长、体质量、体长、胫围有显著影响(P<0.05)，具体表现为：AA基因型和GG基因型的胫长显著(P<0.05)高于AG基因型；GG基因型的体质量显著(P<0.05)高于AG基因型；AG基因型和GG基因型的体长显著(P<0.05)高于AA基因型，GG基因型的胫围显著(P<0.05)高于AA基因型和AG基因型。A57G位点仅对朝鲜鹌鹑的体质量有显著影响(P<0.05)，具体表现为：AG基因型的体质量显著(P<0.05)高于AA基因型，与GG基因型差异不显著(P>0.05)。

表2A57G和A72T位点与鹌鹑第9周龄的体尺性状的相关性分析

Table2Analysis of correlation within A57G and A72T loci and body size traits of quails at 9 weeks of age

同列数据后没有相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

The lowercase letters following the values in the same column showed significant difference (P<0.05). The same as below.

表3IGF-1R基因的组合基因型与鹌鹑第9周龄的体尺性状相关性分析

Table3Analysis of correlation within combined genotypes ofIGF-1Rgene and body size traits of quails at 9 weeks of age

A72T位点对中国黄羽鹌鹑的体质量和胸骨长有显著影响(P<0.05)，具体表现为：AA基因型的体质量显著(P<0.05)高于TT基因型；AA基因型和AT基因型的胸骨长显著(P<0.05)高于TT基因型。A72T位点对北京白羽鹌鹑的胸骨长有显著影响(P<0.05)，具体表现为AA基因型和AT基因型的胸骨长显著(P<0.05)高于TT基因型。A72T位点对朝鲜鹌鹑的胸骨长和胫围有显著影响(P<0.05)，具体表现为：TT基因型的胸骨长显著(P<0.05)高于AT基因型；AA基因型的胫围显著(P<0.05)高于AT基因型和TT基因型。

由表3可知，中国黄羽鹌鹑的AAAA组合基因型的胫长显著(P<0.05)高于其他单倍型；AGAA组合基因型的体质量显著(P<0.05)高于AGAT、AGTT、GGAA、GGAT、GGTT组合基因型；AAAA组合基因型的胸骨长显著(P<0.05)高于AGAA、AGAT、AGTT、GGAT、GGTT组合基因型；AAAA组合基因型的胫围均显著(P<0.05)高于GGAA、GGAT、GGTT组合基因型。北京白羽鹌鹑的AAAA组合基因型的体质量除了与GGAT组合基因型差异不显著外(P>0.05)，显著(P<0.05)高于其他组合基因型(P<0.05)；AAAT、GGAA、GGAT组合基因型的胫长显著高于AGAA组合基因型；GGAA组合基因型的胸深显著(P<0.05)高于AAAA、AATT组合基因型；AAAA组合基因型的胸骨长显著(P<0.05)高于AATT、AGTT、GGAT组合基因型。朝鲜鹌鹑的AGAA组合基因型的体质量显著(P<0.05)高于GGAA、AATT、GGAT组合基因型；AGAT组合基因型的胫长显著(P<0.05)高于GGAT组合基因型；AGAT和GGTT组合基因型的胸宽显著(P<0.05)高于AATT组合基因型。

3 讨论

3.1 IGF-1R基因的多态性分析

类胰岛素生长因子1型受体基因对调控动物生长发育有着非常重要的作用。IGF-1R基因的多态性在不同畜禽中均有报道，如El-Magd等[12]研究了水牛的IGF基因的多态性，在外显子1和外显子4中发现了2个单核苷酸多态性(SNP)位点，即G64A和G280A，并且产生了GGGG、AGAG、AAAA三种单倍型。Ramesha等[13]对印度牛和水牛的IGF-1基因进行了多态性分析，在5′UTR中发现2个SNP位点，在内含子3中发现3个SNP位点，在外显子4中发现2个SNP位点。Cheng等[14]对巴马香猪、藏猪和军牧1号猪3个猪群体的IGF-1R基因的多态性进行了研究，发现g.-1468G>C、g.-1192C>T和g.330，424 C>T这3个突变位点。李伟等[15]研究了IGF-1基因对藏猪和雅南猪生长发育的影响，通过序列比对发现藏猪同源性为100%，雅南猪为99.61%，两者IGF-1基因的序列同源性为99.61%，雅南猪在258 bp发生A/G碱基突变，属于同义突变。IGF-1R基因在家禽中的研究以鸡的研究较多，如金崇富等[1]对鸡的IGF-1R基因进行了多态性研究，结果发现，IGF-1R基因检测到G26333A和G26336A 这2个SNP位点。陈则东等[16]对苏禽黄鸡的IGF-1R基因第16外显子进行了多态性分析，发现IGF-1R基因第16外显子存在2个SNPs位点(C143082G和A143135G)。Yang等[17]对京海黄鸡的IGF-1R基因外显子2进行了多态性分析，发现3个SNP位点，即G26333A、G26336A、C26639T，且每个位点有3个基因型，符合哈代-温伯格平衡定律。对于鹌鹑IGF-1R的多态性分析仅见Moe等[18]的报道。Moe等[18]对日本鹌鹑IGF1R编码区进行了SNP检测，在获得的21个SNP中，一个位于AB292766处的SNP：c.2293G>A导致用异亮氨酸(V765I)替换缬氨酸。本研究在中国黄羽鹌鹑、北京白羽鹌鹑和朝鲜鹌鹑这3个蛋用鹌鹑群体中检测到IGF-1R基因的A57G和A72T两个SNP位点，每个SNP位点存在3种基因型，这一研究结果与Moe等[18]的研究结果不相符，这可能是IGF-1R基因在不同鹌鹑品种群体中的多态性表现不同的缘故。

3.2 IGF-1R基因对体尺性状的影响

高凤华等[19]对东北农大肉鸡的IGF-1R基因进行了多态性分析，发现不同基因型对不同阶段肉鸡体质量有显著影响(P<0.05)。杨凤萍等[20]对京海黄鸡进行了IGF-1R基因外显子3的遗传效应分析，发现2个突变位点，且不同基因型对母鸡的体质量有显著影响(P<0.05)。Moe等[18]研究了IGF-1R基因多态性与日本鹌鹑生长性能的相关性，发现不同基因型对日本鹌鹑不同时期的体质量有显著影响(P<0.05)。武艳平等[21]分析了泰和丝羽乌骨鸡IGF-1基因的第1外显子和5′非编码区序列，第1外显子产生的突变位点对乌鸡体质量有显著影响(P<0.05)。肖超能等[22]对家兔IGF-1基因进行了多态性分析，在外显子3中发现一个突变位点，并检测到CC、TC和TT三种基因型，两种兔的TT基因型对初生质量和日龄质量有显著影响(P<0.05)。Naicy等[23]研究了IGF基因外显子2与山羊体尺性状的相关性，发现一个新的突变位点G80C，发现IGF-1R基因对体质量有显著影响。Yang等[24]研究了IGF-1基因对耗牛生长性状的影响，发现IGF基因对3组耗牛的新陈代谢和生产力有显著影响。Ma等[25]研究了IGF-1R基因与4个牛品种经济性状的关系，发现IGF-1R基因与金南牛的体质量和体高有显著(P<0.05)相关性，与秦川牛的体高有显著(P<0.05)相关性。姬改革等[26]探讨了IGF-1在不同品种鸭胚胎期骨骼肌成肌细胞中的表达差异，通过不同胚龄的研究发现，鸭胚胸肌和腿肌成肌细胞中IGF-1的表达呈现出极显著(P<0.01)的正线性相关。沈留红等[27]对奶牛静脉血及脐静脉血中脂联素、瘦素、IGF-1与犊牛初生体质量的关系进行了研究，发现脐静脉血脂联素、瘦素和IGF-1均对犊牛初生体质量有极显著影响(P<0.01)。可见，IGF基因对动物的生长性状有明显影响。本研究与高凤华等[19]、杨凤萍等[20]、Moe等[18]、武艳平等[21]、肖超能等[22]的研究结果较为相似：发现IGF-1R基因的A57G位点对蛋用鹌鹑的体质量、胫长、胸骨长、体长、胫围有显著影响(P<0.05)，A72T位点对蛋用鹌鹑的体质量、胸骨长、胫围有显著影响(P<0.05)，表明IGF-1R基因与鹌鹑的体尺性状有一定的相关性。因此，IGF-1R基因可以作为候选基因应用于蛋用鹌鹑体尺性状的分子标记辅助选择。