高效液相色谱法测定竹筷中15种防菌防腐剂

周铭林，何海彤，李聪*

广东产品质量监督检验研究院（佛山 528300）

竹筷是以竹材、木材为原材料，经过适当的材质预处理，进行加工后用于食品接触的竹木类食品相关产品[1]。近年来，随着外卖、快餐等餐饮行业迅速发展，竹筷成为必不可少的用餐工具，相应卫生监控问题不断浮现[2-4]，而霉变腐烂问题尤为突出[5-7]，一些生产企业采用价格低廉的化学防腐处理，如大量采用含硫漂煮剂、噻苯咪唑、邻苯基苯酚、联苯、抑霉唑等化学防菌防腐剂，导致该类添加剂在产品中残留超标风险增加，从而增加食品用竹木产品的安全隐患[8-9]。因此，建立高效、简便的检测方法实现竹筷中多种防菌防腐剂同时检测，对该行业的食品安全控制具有重要意义[10]。

中国多数竹木筷产品检测参照GB 19790.1—2005《一次性筷子第1部分：木筷》和GB 19790.2—2005《一次性筷子第2部分：竹筷》[11-12]，该标准规定中只对噻苯咪唑、邻苯基苯酚、联苯、抑霉唑有相应检测方法，而常使用的防菌防腐剂，如苯甲酸、尼泊金酯类、纳他霉素等，尚未建立多种防菌防腐剂同时快速检测方法[13-17]，因此竹木食品相关产品不能得到有效监控。试验运用二极管检测器在230 nm及254 nm波长下检测，外标法定量，建立高效液相色谱法同时分离检测苯甲酸、山梨酸、苯甲醇、富马酸二甲酯、多菌灵、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯、纳他霉素、噻苯咪唑、邻苯基苯酚、五氯酚、抑霉唑、联苯15种常用于食品及日化产品防菌防腐剂。解决检测手段仅能检测常规的几种防菌防腐剂而无法对相关竹木食品相关产品进行有效监控的问题。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇（分析纯，天津致远化学试剂有限公司）；甲醇、甲酸、乙酸铵（色谱纯，德国CNW Technologies GmbH公司）；苯甲酸、山梨酸、五氯酚（中国计量科学院）；苯甲醇、多菌灵、抑霉唑、联苯、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯、邻苯基苯酚、噻苯咪唑（Dr. Ehrenstorfer GmbH）；富马酸二甲酯、纳他霉素（TM standard）。

1.2 仪器与设备

LC-30超高效液相色谱仪（配备二极管阵列检测器，日本岛津公司）；JP-0600超声波清洗机（广州吉普超声波电子设备有限公司）；高速冷冻离心机（美国Sigma公司）；JJ 500 Y电子天平（常熟市金羊砝码仪器有限公司）；Milli-Q超纯水纯化系统（美国Millipore公司）。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配置

准确称取或移取一定量固体标准品及标准储备液至容量瓶中，用甲醇定容配制成混合中间液，使用时根据浓度逐级稀释成系列浓度标准溶液。

1.3.2 样品溶液的配置

将固体样品切割并剪磨为粒径小于5 mm×5 mm颗粒，准确称取1 g（准确至0.001 g）试样于50 mL离心管中，加入10 mL甲醇，拧紧盖子，涡旋混匀后超声提取20 min，在旋涡混匀器上混匀3 min，以3 000 r/min离心3 min，上清液转移至鸡心瓶中用旋转蒸发器蒸发至近干，用甲醇定容至1 mL，过0.45 μm有机滤膜，待测。

1.3.3 色谱条件

色谱柱，Agilent（ZORBAX SB-C18）；柱温30℃；进样量20 μL；流动相，A为0.02 mol/L 乙酸铵溶液（含0.03%乙酸），B为甲醇；流速0.8 mL/min；梯度洗脱；流动相梯度见表1。

表1 流动相梯度变化

2 结果与分析

2.1 检测波长的确定

采用二极管阵列检测器，在190～400 nm对15种防菌防腐剂的标准溶液进行扫描，所有组分均在测试范围内具有吸收峰，其中苯甲酸、富马酸二甲酯在230 nm附近，山梨酸、苯甲醇、尼泊金甲、乙、丙、丁酯、邻苯基苯酚、联苯在250 nm附近有较强吸收，多菌灵、噻苯咪唑、纳他霉素、抑霉唑、联苯在270～300 nm处。由于苯甲酸、山梨酸、苯甲醇、富马酸二甲酯、多菌灵的极性较强，出峰时间短，且多菌灵在230 nm下响应较254 nm处更强，抑霉唑与联苯出峰时间最长，考虑抑霉唑在250 nm附近吸收弱，且出峰时间比联苯早，确定7种组分的检测波长为230 nm，尼泊金甲、乙、丙、丁酯、邻苯基苯酚、噻苯咪唑、纳他霉素、五氯酚的检测波长为254 nm，采用双波长分段检测即可兼顾各组分灵敏度。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 流动相体系的确定

对比食品及化妆品中防腐剂检测常用流动相：甲醇-水、甲醇-乙酸铵、甲醇-乙酸铵（含0.03%乙酸）下各组分的分离效果及出峰时间。结果表明，流动相为甲醇-水时，苯甲酸、山梨酸、尼泊金丙酯峰型不对称，抑霉唑与联苯色谱峰出现部分重叠，影响分离效果；添加乙酸铵后，组分峰型得以改善，但苯甲酸、山梨酸出峰时间提前，苯甲酸与基底杂质峰重叠；流动相为甲醇-乙酸铵（含0.03%乙酸）时，苯甲酸色谱峰可与基底杂质峰分离，且尼泊金丙酯色谱峰可与纳他霉素色谱峰分离。因此，选用甲醇-乙酸铵（含0.03%乙酸）作为流动相。

流动相体系确认后，对甲醇初始比例进行优化（5%，20%，30%和40%），甲醇比例5%时，试验需58 min，逐步提高初始甲醇浓度至40%，试验时长可缩短至44 min，且各组分分离可保持良好。因此，以40%作为初始甲醇浓度。

2.2.2 色谱柱的选择

高效液相色谱法检测防菌防腐剂主要采用C18柱，试验比较Thermo Hypersil GOLD C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Extend-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μ m）及耐酸色谱柱Agilent Zorbax SBC18（250 mm×4.6 mm，5 μm），150 mm色谱柱未能将所有组分完全分离，而组分在Extend-C18色谱柱及耐酸色谱柱中保留时间没有显著性差异，耐酸色谱柱较长柱优势在于在同等试验条件下苯甲醇色谱峰吸收更强，且流动相为酸性条件，酸柱在低pH条件下，具备良好稳定性。

2.2.3 流速的选择

分析不同流速（0.7，0.8和0.9 mL/min）对各组分分离效果的影响，试验表明，流速增快，各组分保留时间提前，但整体分离效果变化不大，考虑0.9 mL/min流速柱压较0.8 mL/min高，试验选用流速0.8 mL/min，在最优试验条件下获得的标准样品图见图1，尼泊金丁酯阳性样品图见图2。

2.3 方法的线性范围与检出限

在最佳色谱条件下，对混合标准溶液进行测定，以峰面积为纵坐标Y，质量浓度为横坐标X，绘制线性回归方程，得到各化合物的线性回归方程。以3倍信噪比计算方法检出限，结果见表2。

2.4 方法的准确度与精密度

选取空白试样，采用试验前处理方法处理后，添加3个不同水平的标准溶液，每个添加水平重复测定6次，计算平均回收率和相对标准偏差（RSD%），结果见表3。

图1 15种标准品图谱

图2 尼泊金丁酯检出样品

表2 线性范围、回归方程与检出限

表3 样品的加标回收率及精密度（n=6）

2.5 实际样品分析

采用该方法随机选取市售的30批次竹木筷子进行检测，结果在30批次产品中，4个批次产品检出尼泊金丙酯，浓度在3.2～5.4 mg/kg之间，2个批次产品检出尼泊金乙酯，1个批次检出浓度为5.2 mg/kg，抑霉唑，未发现超限量使用情况。

3 结论

建立一种同时测定竹筷中15种防菌防腐剂的高效液相色谱检测方法，对色谱分离条件进行优化，以0.02 mol/L乙酸铵（含0.03%乙酸）和甲醇溶液为流动相进行梯度洗脱，采用二极管阵列检测器进行检测，达到良好分离效果。该方法操作简单，准确度精密度均可满足日常监测需求。