离子液体双水相萃取-HPLC测定饮料中的8种合成着色剂

胡贝*，李丽霞，李晓健，刘红，黄伟，王林

湖北省药品监督检验研究院（武汉 430075）

合成着色剂是在食品生产加工过程中，为改善食品色泽、增进人的食欲而添加的一类食品添加剂，大多以煤焦油中分离出的苯胺染料为原料制成[1]。合成着色剂由于其色泽鲜艳、性质稳定、着色力强、成本低廉等诸多优点，迅速得到广泛的推广与应用[2-3]。但合成着色剂不仅无任何营养价值，且绝大多数对人体有害，毒害作用不仅表现为一般毒性和致泻性，有些品种还具有致癌性[1-2]。目前，国家标准[4]、进出口行业标准[5]及文献报道[1]中测定食品中合成着色剂的前处理方法主要有聚酰胺粉吸附法、液-液萃取法、固相萃取法等，检测方法主要有液相色谱法、液相色谱-质谱联用法。此外，QuEChERS-HPLC法[6]、QuEChERS-HPLC-MS/MS法[7]、SERS法[8-9]、离子液体分散液-液微萃取-HPLC法[10]等快检方法也逐渐被应用于合成着色剂的检测中，但这些方法大多会使用有机溶剂，存在污染。因此，寻求一种简单、绿色、高效的检测方法成为亟待解决的问题。

Gutowski等[11]2003年首次提出了离子液体双水相（ILATPS）的概念，并研究了亲水性离子液体[C4mim]Cl与K3PO4形成上相富集离子液体和下相富集磷酸钾的双水相体系。按照与离子液体形成双水相体系的对象不同可以将其分为3种类型：离子液体/无机盐体系、离子液体/表面活性剂体系与离子液体/糖体系，其中研究比较多的是离子液体/无机盐体系，以磷酸盐类的成相效果最好且应用最广[12]。离子液体双水相体系，它综合了离子液体和双水相体系的优点，具有分相时间短、黏度低、萃取过程不易乳化、萃取率高、分离条件温和、离子体系易回收利用、绿色环保等优势[12-14]。

近年来，离子液体双水相萃取法在生物工业分析、药物分析、金属分离等领域的应用成为了研究的热点[14]，在合成着色剂的萃取分离研究中，也逐渐被关注。邓凡政等[15]建立了一种用离子液体双水相体系对苋菜红进行萃取的方法。Sha等[16]建立了一种用离子液体双水相体系对不同食品样品中5种合成着色剂进行萃取的方法。但目前国内外运用离子液体双水相体系检测食品中多种常用合成着色剂的方法报道仍然较少，因此，试验建立了一种离子液体双水相萃取-高效液相色谱法快速检测饮料中8种合成着色剂（新红、靛蓝、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、酸性红和赤藓红）的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

1260型高效液相色谱仪（安捷伦科技（中国）有限公司）；ST16型台式离心机（德国Thermo公司）；XP 205型电子分析天平（瑞士梅特勒公司）；HMV-50A型多管漩涡混合器（上海珂淮仪器有限公司）；Milli-Q纯水机（德国默克公司）。

1.2 标准物质与试剂

新红（农业部环境保护科研监测所）；日落黄、胭脂红、亮蓝、赤藓红（中国计量科学研究院）；诱惑红（北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司）；酸性红（德国Dr. Ehrenstorfer GmbH）；靛蓝（北京北方伟业计量技术研究院）。

甲醇（色谱级，德国默克公司）；乙酸铵（优级纯，天津市大茂化学试剂厂）；硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸钾、磷酸二氢钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；柠檬酸（分析纯，上海山浦化工有限公司）；1-丁基-3-甲基咪唑溴盐（[C4MIM]Br）、1-癸基-3-甲基咪唑溴盐（[C10MIM]Br）、1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（[C6MIM]BF4）、1-辛基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（[C8MIM]BF4）（纯度均为99%，上海成捷化学有限公司）；试验用水为GB/T 6682规定的一级水。0.3 g/mL的[C4MIM]Br水溶液及200 g/L的柠檬酸水溶液，均用蒸馏水配制。

1.3 色谱条件

色谱柱：Thermo AcclaimTM120 C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流速1.0 mL/min；柱温30 ℃。检测波长：新红，508 nm；靛蓝，288 nm；胭脂红、日落黄、诱惑红，240 nm；亮蓝，628 nm；酸性红，518 nm；赤藓红，530 nm。进样量10 μL；流动相梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序

1.4 标准储备溶液配制

1.0 mg/mL酸性红标准储备溶液：称取适量酸性红标准品于10 mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，摇匀即得。

1.5 样品处理

1.5.1 样品溶液的制备

取空白饮料样品（含二氧化碳样品加热或超声10 min驱除二氧化碳），用200 g/L的柠檬酸水溶液调节pH至6.0，经0.22 μm微孔滤膜过滤，备用。

1.5.2 离子液体双水相萃取

在10 mL的离心管中加入500 μ L 0.3 g/mL的[C4MIM]Br，和一定量的混合标准溶液或样品溶液（1.0 mL），加水稀释至5.0 mL，然后加入5.5 g K2HPO4，涡旋10 min使其充分溶解并形成浑浊的溶液，以8 000 r/min离心5 min，富集离子液体的上相体积约为120 μL。取10 μ L注入高效液相色谱分析测定。

1.6 定量分析

合成着色剂在双水相中的萃取效果通过萃取率（E）描述[17]。按式（1）计算：

式中：Vt为萃取后上相体积，mL；Ct为所测溶液中合成着色剂的质量浓度，μg/mL；V为加入的标准溶液体积，mL；C为标准溶液质量浓度，μ g/mL。

2 结果与讨论

2.1 离子液体的选择

试验考察了[C4MIM]Br、[C10MIM]Br、[C6MIM]BF4、[C8MIM]BF4共4种离子液体对8种合成着色剂的萃取效率（每组3个平行样）。结果表明，通过短时间（约30 s）手动振摇，离子液体的相分离能力顺序为：[C6MIM]BF4≈[C8MIM]BF4＜[C4MIM]Br≈[C10MIM]Br。考虑到[C4MIM]Br的成本和黏度均低于[C10MIM]Br，选择[C4MIM]Br进行进一步研究。

2.2 盐种类的选择

作为双水相体系的重要组成部分，无机盐的性质对双水相体系的相平衡具有重要的影响。Gutowski等[11]和Sha等[16]的研究均揭示了离子液体/无机盐双水相体系的分相过程实质上是无机盐与离子液体争夺水分子的过程，其分相能力与离子液体的水化能力和无机盐的盐析能力密切相关，离子液体的水化能力越大分相能力越差，而无机盐的盐析能力越大其分相能力越强。试验选择了(NH4)2SO4、NaH2PO4、K3PO4、K2HPO4共4种盐进行试验（每组3个平行样）。其中，K3PO4、K2HPO4能与[C4MIM]Br形成双水相体系，相分离能力的顺序为K3PO4＜K2HPO4，此顺序与它们常温下的水溶性是一致的。故选择K2HPO4进行进一步研究。

2.3 pH的选择

溶液的pH是影响萃取效率的一个重要因素，溶液的酸碱性会影响萃取物在溶液中的存在形式，因此调节溶液的pH从而改变萃取物在溶液中的溶解度，使萃取物更易在萃取溶剂中存在，以达到萃取的目的[10,18]。 根 据 国 家 标 准[4]、 进 出 口 行 业 标 准[5]及 文献[10, 15-16]报道，考察了pH 4.0～6.0对萃取率的影响（每组3个平行样），结果表明，在pH 6.0时，萃取率最高。因此，在制备样品溶液时，选择调节pH至6.0后备用。

2.4 离子液体加入量的影响

离子液体的加入量是决定萃取率的关键因素，得到一种离子液体加入量少、萃取率高的双水相体系十分重要。当[C4MIM]Br的加入量低于300 μL时，上相体积太小，移取困难，无法进行检测，故考察了[C4MIM]Br的加入量在300～700 μL范围内对萃取率的影响（每组3个平行样），结果见图1。[C4MIM]Br的加入量在300～500 μL范围内随其加入量的增加，8种合成着色剂的萃取率呈递增趋势，当[C4MIM]Br的加入量为500 μL时，8种合成着色剂的萃取率最高。综合考虑萃取率、富集倍数和降低[C4MIM]Br的使用成本，选择加入500 μ L 0.3 g/mL的[C4MIM]Br水溶液进行后续试验。

图1 离子液体加入量对8种合成着色剂萃取率的影响

2.5 盐加入量的影响

试验考察了K2HPO4的加入量在5.0～6.5 g范围内对萃取率的影响（每组3个平行样），结果见图2。在5.0～6.5 g范围内，8种合成着色剂的萃取率均在K2HPO4的加入量为5.5 g时达到最大值。因此，为了达到更高的萃取效率，选择K2HPO4的加入量5.5 g。

图2 盐加入量对8种合成着色剂萃取率的影响

2.6 萃取时间和离心时间的影响

通过添加一定量的盐，很容易形成离子液体双水相体系。试验比较了手动振摇30 s（从添加盐到离心之前的时间）、涡旋5 min、涡旋10 min、涡旋15 min共4种不同萃取时间对萃取率的影响（每组3个平行样）。结果表明，涡旋10 min相较于其他萃取时间的萃取率更高。为使上下相达到快速的分离，研究了以8 000 r/min离心5～20 min对萃取率的影响。试验发现，离心时间5 min以上，8种合成着色剂的萃取率基本不变，为了节省实验时间，选择离心时间5 min。

2.7 线性范围及检出限

分别量取适量标准储备溶液，加水定容至刻度，配制成质量浓度为1.0 mg/mL的混合标准溶液。再将1.0 mg/mL混合标准溶液作为母液，用pH 6的水（用200 g/L的柠檬酸水溶液调节pH至6.0）分别稀释成质量浓度为30，60，300，600和1 200 μg/L的混合标准工作溶液，在所优化的试验条件下富集、高效液相色谱检测，以各个组分的峰面积和浓度绘制标准曲线，以3倍信噪比计算检出限，结果见表2。

表2 各组分的线性方程、线性范围、相关系数及检出限

2.8 加标回收率和精密度试验

表3 精密度与回收率试验结果（n=6）

图3 混标及空白样品加标色谱图

取空白饮料样品，分别添加适量混合标准溶液，使3组样品（每组6个平行样）中各组分的加标量分别为50 μg/L（低），250 μg/L（中）和500 μg/L（高）三个水平，按“1.5”处理样品进行回收试验，计算回收率和测定值的相对标准偏差（RSD），结果见表3。混标色谱图和空白样品加标色谱图见图3。结果表明，各组分的平均回收率为86.5%～99.0%，RSD为0.3%～3.8%。该方法回收率和重现性良好，结果准确可靠，可以采用外标法进行准确定量。

3 结论

试验建立了一种离子液体双水相萃取-高效液相色谱法快速检测饮料中8种合成着色剂（新红、靛蓝、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、酸性红和赤藓红）的方法，对萃取剂的种类及体积、盐的种类及添加量、样品pH、萃取时间、离心时间等因素进行了优化。同时考察了方法的线性范围、方法检出限、加标回收率及精密度等。试验证明，该方法绿色环保、操作简单、灵敏度高、回收率和重现性良好，可以为饮料中8种合成着色剂的大批量快速检测提供依据。