贮藏及热处理对桑葚酒中多酚类物质含量的影响

李杰，王虹然，林泽斌*，黄建香，李小定

1. 广东暨晴生物医药科技有限公司（惠州 516081）；2. 华中农业大学食品科技学院（武汉 430070）

桑葚（Mulberry）是桑科桑属落叶乔木桑树的成熟果穗，色泽艳丽、肉质甘甜油润，素有“民间圣果”之美誉[1-2]。其富含丰厚的有机酸、糖、游离氨基酸、多种维生素以及微量元素，能药食两用，用其压榨果汁制作的酒也颇具风味。桑葚酒是潮汕地区古老的果酒，含有丰富的花青素、白藜芦醇等多酚类活性物质，有抗氧化、延迟老化、降血压、防龋齿、防辐射、抗过敏、抗癌、抗血小板凝聚、消炎等功能[3]。

花青素等多酚类物质是植物在正常生长以及应激反应过程中产生的次级代谢产物[4]。桑葚富含桑葚红色素，为水溶性花青素，其强大的抗氧化和清除自由基的能力来源于分子中高含量的酚羟基[5]。国内对桑葚花青素的研究主要集中在提取工艺和稳定性方面[6-9]，而对其多酚类物质在贮藏过程中的稳定性研究较少。Jia等[10]、Dastmalchi等[11]研究表明桑葚花青素对光、温度、pH等十分敏感；亦有研究证明桑葚红色素对温度耐受性较差，高温易降解[12]。pH示差法能够简单快速地测定花青素的含量，是目前使用最多的方法[13-14]。花青素具有强大的抗氧化活性，其测定方法主要有邻苯三酚法、硫代巴比妥酸法、过氧化值法、水杨酸法、普鲁士蓝法等[15]。试验采用水杨酸法测定桑葚酒的抗氧化活性大小。

在贮藏过程中，食品中的主要营养成分会发生一系列的变化，通过改变贮藏温度考察桑葚酒中多酚类物质含量的变化，以确定最佳贮藏温度及时间，为延长其货架期提供理论指导依据。分别选取贮藏温度为4，25和45 ℃，即探究在冷藏、室温放置及炎热高温气候放置的状态下桑葚酒中多酚类物质含量的变化。同时，热处理工艺是食品工业生产加工时最常见的处理手段之一，由于花青素对温度十分敏感，在热处理过程中会慢慢降解[16-17]，因此更需要探究在不同热处理温度的条件下，桑葚酒中热敏性成分（如花青素）含量的波动情况，进而加以避免及控制，试验通过检测桑葚酒在60，70和80 ℃温度的热处理过程中5 h内花青素含量的变化并进行对比，为进一步探究热处理温度对花青素含量的影响提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桑葚酒（桑葚干红）：湖北圣果酒庄有限公司，原汁含量100%，酒精度12%vol，置于阴凉处避光备用。

无水乙醇、盐酸、30%过氧化氢、福林-酚试剂、无水碳酸钠、氯化钾、三水合乙酸钠、氢氧化钠、水杨酸、七水合硫酸亚铁、九水合硝酸铝、芦丁标准品、没食子酸标准品均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

723可见光分光光度计（天津普利莱斯仪器有限公司）；AL204电子天平（Mettler Toledo仪器有限公司）；KQ2200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SHB-III循环水式多用真空泵（郑州恒岩仪器有限公司）；pH计（美国Mettler Toledo仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 桑葚酒的贮藏及热处理

取80 mL桑葚酒于100 mL离心管中，充氮后盖好盖，分别置于4，25和45 ℃温度的恒温箱中保存、待测，贮藏稳定性监测周期为10 d。

桑葚酒用具塞玻璃试管分装后在60，70和80 ℃温度下水浴加热，每间隔一定时间取样，立即冰水浴冷却后检测花青素含量，热处理稳定性监测周期为5 h。

1.3.2 总酚含量的测定

没食子酸标准曲线的绘制：根据吴晓敏等[18]报道的方法改进后进行检测。具体方法：精确称量10.0 mg没食子酸标准品于100 mL容量瓶中，添加部分蒸馏水后超声溶解1 min，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，得质量浓度为0.1 mg/mL的标准液。精确移取标准液0，0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 mL于10 mL容量瓶中，按序添加2 mL水、0.5 mL福林酚试剂，混匀，1 min后加入1.5 mL 20%的碳酸钠溶液，混匀后用蒸馏水定容至刻度，摇匀，超声10 s除去气泡，室温下避光静置20 min后，以没有加入标准液的试管为参比，在765 nm下测定吸光度。横坐标x为没食子酸质量浓度（mg/mL），纵坐标y为吸光度做线性回归曲线，获得没食子酸标准曲线的线性方程及相关系数，即y=0.122 4x+0.048 7（R2=0.998 8）。

检测前，将桑葚酒进行稀释，使其吸光度在0.2～0.8之间。确定稀释倍数后，取0.5 mL其稀释液置于10 mL比色管中，按序添加6 mL蒸馏水、0.5 mL福林-酚试剂后混匀，静置1 min后加入1.5 mL 20%的碳酸钠溶液，混匀后用蒸馏水定容至刻度。以不加样品的试管为参比，在765 nm处测定其吸光度，然后根据没食子酸标准曲线计算样品中的总酚含量。

1.3.3 总黄酮含量的测定

芦丁标准曲线的绘制：根据张琪等[19]的测定方法（福林酚法）进行优化。具体方法：精确称取2.5 mg芦丁标准品于50 mL容量瓶中，添加适量75%的乙醇溶液，超声溶解后定容至刻度，摇匀，获得质量浓度为0.050 mg/mL的芦丁标准液。精确移取芦丁标准液0，1，2，3，4和5 mL于50 mL容量瓶中，分别加入15 mL无水乙醇、1 mL 100 g/L硝酸铝溶液、1 mL 1 mol/L乙酸钾，混匀后用蒸馏水定容至刻度，摇匀，超声溶解10 s去除气泡，室温下静置1 h后以不含芦丁标准使用液的试管为参比，在415 nm下测定吸光度。以芦丁溶液质量浓度（mg/mL）为横坐标x，吸光度为纵坐标y做线性回归曲线，获得芦丁标准曲线的线性方程及相关系数，即y=0.035 5x+0.024 7（R2=0.999 0）。

检测前，将桑葚酒稀释合适倍数使得吸光度在0.2～0.8之间，取4 mL样品稀释液，按序添加1 mL 100 g/L硝酸铝溶液、1 mL 1 mol/L乙酸钾溶液，混匀后用水定容至刻度，超声10 s去除气泡，室温下静置1 h后以只加水的桑葚酒为参比，在415 nm下测定其吸光度，根据芦丁标准曲线计算样品中的总黄酮含量。

1.3.4 花青素含量的测定

花青素的色度随pH的改变而发生变化，而干扰物质特征光谱不随pH的改变而改变。当pH 1时，花青素以2-苯基苯并吡喃（红色）的方式存在；当pH 4.5时，花青素以甲醇假碱（无色）的形式存在。根据朗伯-比尔定律可得出，在两个pH下，花青素溶液的吸光度的差值与花青素的含量成比例。花青素含量的测定采用pH示差法[20]，其含量表示为矢车菊素-3-葡萄糖苷当量。检测前，将样品进行稀释使其吸光度在0.2～0.8之间，即分别取样品1 mL至两支10 mL比色管中，其中一支添加9 mL pH 1.0的缓冲液，另一支添加9 mL pH 4.5的缓冲液，室温下避光静置30 min后在510和700 nm下测定样品的吸光度。

式中：A为吸光度，计算方法为A=（A510-A700）pH1.0-（A510-A700）pH4.5；MW为矢车菊素-3-葡萄糖苷分子量449.2，Da；DF为稀释倍数；ε为矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔吸光系数，26 900；L为光程长，1 cm。

1.3.5 羟自由基清除率的测定

储备液的制备：精确称取0.208 5 g七水合硫酸亚铁固体于100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，得到7.5 mmol/L的硫酸亚铁溶液；精确称取0.103 6 g水杨酸固体于100 mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，得到7.5 mmol/L的水杨酸乙醇溶液；精确称取0.17 g 30% H2O2溶液于100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，得到7.5 mmol/L的过氧化氢溶液以备用。将三者1︰1︰1混合，得到300 mL储备液，备用。

测定步骤：根据赵平等[21]的方法（水杨酸法）优化后进行检测。取3支10 mL比色管并分别标号（1～3），移取桑葚酒0.5 mL于2和3号比色管中，再取2 mL储备液依次加入至1和2号比色管中，用蒸馏水将3支比色管定容至刻度后在526 nm处测定其吸光度，1号为A0，2为A1，3号为A2。羟自由基清除率I=[1-（A1-A2）/A0]×100%。式中：I为花青素对OH·的清除率，%；A0为储备液的吸光度；A1为含样品及储备液的吸光度；A2为只含样品的吸光度。

1.4 数据处理方法

采用Excel和Origin软件进行数据处理和分析，每个试验进行3次重复，p＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 贮藏过程中桑葚酒中总酚含量的变化

如图1所示，在4 ℃的贮藏条件下桑葚酒中总酚含量呈现出先下降再平稳的趋势，在贮藏4 d后总酚含量最低（779.18 μg/mL）；在25 ℃的贮藏条件下桑葚酒中总酚含量呈现出先下降再上升的趋势，在贮藏2 d后降到最低含量（836.56 μ g/mL），5 d后上升趋势趋于平稳；在45 ℃的贮藏条件下桑葚酒中总酚含量呈现出逐渐下降的趋势，在贮藏10 d后降到最低含量（737.42 μg/mL）。经过显著性分析，在三种储藏温度下，桑葚酒中多酚含量均存在着显著性差异。结果表明，冰箱冷藏或夏日炎热气候均会导致桑葚酒中总酚含量的下降，为保持桑葚酒中的多酚类物质，在25℃贮藏较为适宜。

图1 桑葚酒总酚含量变化曲线

2.2 贮藏过程中桑葚酒中总黄酮含量的变化

如图2所示，在4 ℃的贮藏条件下桑葚酒中总黄酮含量呈现出不断波动的趋势，但整体上呈现出减小的趋势，贮藏10 d后降低到最低含量（130.03 μg/mL）；在25 ℃的贮藏条件下桑葚酒中总黄酮含量也呈现出波动的趋势，但整体保持持平的趋势，贮藏10 d后含量为155.02 μg/mL，较初始状态略高；在45 ℃的贮藏条件下桑葚酒中总黄酮含量呈现出与4 ℃条件下类似的上下浮动趋势，贮藏10 d后总黄酮含量仅为134.01 μg/mL。通过显著性差异分析，在4与45 ℃贮藏温度下，二者的总黄酮含量无显著性差异，而在25℃时，其总黄酮含量与前二者有显著性差异。结果表明，在25 ℃贮藏条件下，桑葚酒总黄酮含量显著高于其余两个贮藏温度，因此从总黄酮含量的角度考虑，桑葚酒更适宜在常温25 ℃的条件下贮藏。

图2 桑葚酒总黄酮含量变化曲线

2.3 贮藏过程中桑葚酒中花青素含量的变化

如图3所示，在4和25 ℃的贮藏条件下桑葚酒中花青素保留率呈现出逐步缓慢下降的趋势，在贮藏10 d后均达到保留率66%左右；但在45 ℃的贮藏条件下桑葚酒中花青素保留率呈现出急速下降的趋势，在贮藏10 d后花青素保留率最低，仅为26.03%。通过显著性分析，在4和25 ℃贮藏条件下，二者的花青素保存率无显著性差异；而在45 ℃时桑葚酒中花青素保留率与前二者有显著差异。试验结果表明，桑葚酒在4和25 ℃温度下花青素保留率明显高于45 ℃，从花青素含量的角度考虑，桑葚酒更适宜于在冷藏及常温条件下贮藏。

图3 桑葚酒花青素保留率变化曲线

2.4 贮藏过程中桑葚酒羟自由基清除率的变化

如图4所示，在4，25和45 ℃的贮藏条件下桑葚酒羟自由基清除率呈现出不断波动的趋势，波动范围在89.37%～100%之间。通过显著性分析，在4和25 ℃贮藏条件下，二者的羟自由基清除率无显著性差异；而45 ℃时其羟自由基清除率与前二者均有显著性差异。结果表明，桑葚酒在4和25 ℃贮藏温度下羟自由基清除率高于45 ℃，但在45 ℃的温度下，桑葚酒中抗氧化活性成分的羟自由基清除率虽下滑趋势明显，但仍处于90%左右的较高水平。在低温贮藏条件下，桑葚酒的抗氧化稳定性更强。

图4 桑葚酒羟自由基清除率变化曲线

2.5 热处理过程中花青素保留率的变化

2.5.1 热处理过程中桑葚酒中花青素保留率变化曲线

根据图5所示，桑葚酒在热处理温度为60，70和80 ℃条件下，花青素保留率均呈现出逐步下降的趋势，经过5 h热处理后其花青素保留率分别为78.33%，72.00%和57.68%。热处理温度越高，处理时间越长，桑葚酒中花青素保留率越低。通过显著性差异分析可知，热处理温度为60，70和80 ℃时花青素保留率均有显著性差异。

图5 桑葚酒热处理花青素保留率变化曲线

2.5.2 热降解动力学解析

在恒温加热的条件下，花青素的降解遵循一级降解动力学模型[14,22-24]。一级降解动力学模型的参数速率常数（k）、半衰期（t1/2）、活化能（Ea）和温度系数（Q10）按式（1）～（4）计算。

式中：Ct为在时间t（h）时的花青素保留率，%；C0为花青素最初时的保留率，即100%；R为摩尔气体常数，8.314 J/（mol·K）；T为绝对温度，K。

由图6可知，桑葚酒花青素保留率-lnCt/C0与热处理时间t之间呈现较好的线性关系，相关系数均大于0.98，说明桑葚酒中花青素的热降解反应符合一级反应动力学规律，动力学方程为t=（lnC0-lnCt）/[（1.71×105）×EXP（-5 014.43/T）。

图6 桑葚酒花青素在热处理过程中-ln(Ct/C0)与加热时间的关系

不同热处理温度下桑葚酒花青素热降解速率常数k、半衰期t1/2、活化能Ea及温度系数Q10的数值见表1。结果表明，热处理温度对桑葚酒花青素的稳定性有较大的影响，随着热处理温度的升高，花青素降解的速率常数k随之上升，而半衰期t1/2随之下降。据报道，原榨血橙果汁中花青素的t1/2在70，80和90 ℃温度下分别是8.21，5.33和2.79 h[25]；在80 ℃时紫甘薯花青素的t1/2为96.3 h[14]。通过比较发现，桑葚酒花青素在热加工处理时其t1/2比血橙花青素略高，但远低于紫甘薯花青素。温度系数Q10在60～70 ℃为1.36，在70～80 ℃为1.73，仍呈现出上涨的趋势，表明随着热处理温度的继续上升，桑葚酒中花青素降解速率会变得更快。

表1 桑葚酒花色苷热降解动力学常数

3 结论与讨论

关于确定桑葚酒的最佳贮藏温度，试验从四个维度（总酚含量、总黄酮含量、花青素保留率和羟基自由基清除率）来考虑：（1）从总酚含量的角度，桑葚酒在常温25 ℃的温度下总酚含量较高且比较稳定；（2）从总黄酮含量的角度，桑葚酒在三个贮藏温度下波动幅度均较高，但在25 ℃贮藏温度下总黄酮的含量要明显高于其他两个温度；（3）从花青素保留率的角度，桑葚酒在4和25 ℃条件下花青素保留率相近且无显著差异，均远高于45 ℃时的保留率；（4）从对羟基自由基清除率的角度，桑葚酒波动幅度均较小，其中在4与25 ℃的贮藏温度下无显著性差异。综合以上四个指标可以得出初步判定，桑葚酒的最佳贮藏温度为25 ℃，可使桑葚酒中的多酚类物质含量损失得最少。在对桑葚酒进行热处理的过程中，可以看出桑葚酒中花青素的保留率都是随着热处理温度的升高以及加热时间的延长而减少。通过对桑葚酒热降解动力学模型的分析可得出桑葚酒热降解符合一级反应规律，动力学方程为t=（lnC0-lnCt）/[（1.71×105）×EXP（-5 014.43/T）。

此次试验对桑葚酒最佳贮藏温度的确定及热处理时花青素保留率的变化情况进行了研究，虽取得一些突破但也有很多需要继续完善的地方，比如贮藏及热处理温度可以更加丰富、桑葚制品可以不局限于桑葚酒等。希望此研究能对桑葚酒的贮藏提供理论依据，为延长其货架期做出贡献。