渤海虾酱中益消细菌的分离和鉴定

陈笑语 张力元 纪海玉 刘安军

（天津科技大学食品工程与生物技术学院 天津300457）

渤海虾酱酱色鲜艳，酱质细腻，组织均匀，气味鲜香、口感好，酱香味和虾鲜味浓郁，含有优质的蛋白质、钙、铁、硒、维生素A 和脂肪酸等营养元素。虾酱中还有虾青素和甲壳素两个重要的因子，其中被称为超等维生素的虾青素，具有维生素A、维生素E 和β 胡萝卜素，可以改善免疫力，阻挡紫外线的伤害，提高视力能力，还可避免不饱和脂肪酸被氧化。甲壳素具有降血压、降低胆固醇以及抗菌等功能。

近年来研究发现，虾酱的风味和保健活性与其中的微生物菌群密切相关。孙业盈等[1]通过研究蜢子虾酱，分离鉴定出一株嗜盐菌，经鉴定确定为盐脱氮枝芽孢杆菌，其属于枝芽孢杆菌属。连鑫等[2]对虾酱中呈味优势菌种进行挑选、分离鉴定，发现一株产香酵母，为季氏毕赤氏酵母，分析结果表明：菌株耐受高盐环境，对菌株进一步纯化，提高耐盐性，用于低盐虾酱的发酵，提高虾酱发酵香气，控制产品质量。连鑫等[3]从虾酱中分离出一株产蛋白酶霉菌，确定为黑曲霉，通过研究其在虾酱生产中各种因素对于风味变化的影响，对其产蛋白霉菌进行改造，为传统发酵产品的工业化生产提供优质的菌株。

传统虾酱中由于含有多种多样的微生物菌群，因此形成了比较稳定的微生物系统[4]，风味良好，营养丰富，具有多种保健功能。鉴于目前对虾酱的研究主要集中在风味物质的相关菌群方面，而对其益消细菌鲜有研究报道。本研究用营养琼脂培养基对渤海虾酱中的细菌进行分离，采用PCR 测序技术对其进行鉴定，并研究该菌株的耐热性，为虾酱在食品加工过程中的合理利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

渤海虾酱：黄骅市王曼老李水产品有限公司。

培养基：PDA 培养基、营养琼脂培养基、高氏一号培养基、马铃薯蔗糖MRS 培养基、营养肉汤培养基，购买于北京路桥技术有限责任公司。

试剂：无水乙醇，天津市科密欧化学试剂有限公司；27F 引物和1492R 引物，北京鼎国盛世有限公司。

1.2 仪器与设备

电泳仪，美国Thermo 公司；冷冻离心机，美国Thermo 公司；电热恒温培养箱，北京中兴伟业仪器有限公司；真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 传统虾酱生产工艺 工艺流程：原料去杂洗涤→装入瓷缸→加入盐度为25%～30%的盐水→拌匀→控制温度25～30 ℃发酵→30 d 后油、酱分离→包装巴氏灭菌。虾酱中盐度一般控制到27%左右为佳，盐分过高过低都会直接影响微生物的生存以及虾酱的口感。

1.3.2 细菌的分离和纯化 在无菌条件下，取虾酱样品1 g 于锥形瓶中，注入9 mL 蒸馏水振荡摇匀（8 000 r/min，5 min），按10-1，10-2，10-3 梯度稀释并涂布于营养琼脂培养基中，37 ℃恒温培养48 h。然后用接种环挑取分离得到的细菌菌株，接种到营养琼脂培养基上培养进行纯化，37 ℃恒温培养48 h。

1.3.3 细菌的形态学鉴定 用接种环挑取分离纯化后的细菌菌株，接种到营养肉汤培养基上，37℃恒温培养48 h，观察并记录培养皿中菌落的形态特点，观察菌落形态并计数，然后通过革兰氏染色，光学显微镜观察其形态。

1.3.4 细菌的生理生化试验 根据《The Yeasts：A Taxonomic Study》对分离菌株进行糖、醇发酵试验、V-P 试验、甲基红（Methyl Red）试验、靛基质吲哚试验。

1）糖、醇发酵试验：将分离纯化后的菌株做糖发酵试验，检验菌株对各种糖醇类碳源的利用情况，将菌株制备成菌悬液，将装有培养液的杜氏小管倒置放入试管中，置于37 ℃恒温箱中培养5 d，如果颜色为紫色无气泡，不产酸不产气为阴性；如果颜色为黄色无气泡，产酸不产气为阳性；如果颜色为黄色有气泡，产酸产气为0。测定的糖类（醇、糖苷）包括：葡萄糖、蔗糖、甘露糖、乳糖（1.5%）、半乳糖（1.5%）、D-山梨醇、果糖、阿拉伯糖、麦芽糖、纤维二糖、木糖、水杨苷等[5-7]。

2）乙酰甲基甲醇V-P 试验：将分离纯化后的菌株做V-P 试验，将试验菌接种于上述培养基，于36 ℃±1 ℃培养4 d、培养液2.5 mL，先加入a 萘酚 （2-na-phthol）纯酒精溶液0.6 mL，再加40%氢氧化钾水溶液0.2 mL，摇动2～5 min，若出现红色，可判定为阳性细菌，若无红色出现，静置于36 ℃±1 ℃恒温箱，如2 h 内仍不显现红色，可判定为阴性细菌。

3）甲基红（Methyl Red）试验：将分离纯化后的菌株做甲基红试验，挑取新的待试纯培养物少许，接种于通用培养基，30 ℃培养3～5 d，从第2 天起，每日取培养液1 mL，加甲基红指示剂1～2 滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。至发现阳性或至第5 天仍为阳性，即可判定结果。

4）靛基质吲哚试验 ：将分离纯化后的菌株做靛基质吲哚试验，取装有蛋白胨水培养液的试管5 支，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌、枯草芽孢杆菌和空白对照。以无菌操作分别接种少量菌苔到以上相应试管中，第5 管作空白对照不接种，置37 ℃恒温箱中培养24～48 h。在培养液中加入乙醚1～2 mL，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5～10 滴吲哚试剂，如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应，阳性用“+”、阴性用“-”表示。

1.3.5 16 SrDNA 序列分析及系统发育树构建方法采用煮沸法提取目的基因，参照细菌的16sDNA序列分析，选取细菌1492R 与27F 通用引物（见表1），进行PCR 反应。选择单菌落作为目的模板，反应条件：变性94 ℃，1 min，退火58 ℃，45 s，延伸72 ℃，45 s，一共需要29 个循环。用移液器吸取5 μL PCR 扩增产物，开始琼脂糖凝胶电泳反应，根据图判断扩增产物的分子质量大小，并保存观察，将扩增成功的PCR 产物送检（PCR 产物的测序工作由北京鼎国盛世有限公司完成）。将测序结果登录NCBI 网站用BLAST 程序进行序列比对，用ClustalX 2 软件进行多序列比对（Multiplealignments），用软件MEGA5.2 进行分析获得系统进化树[8-9]。

分子鉴定试验步骤：

目的基因的提取：取隔夜的菌液1 mL 于离心管中，振荡摇匀（11 000 r/min，1 min），弃上清液，再取1 mL 菌液，离心，然后取150 μL 灭菌水吹洗菌体沉淀物，离心，弃上清液，反复洗涤2 次。用一次性手套包上离心管，开水煮10 min（煮沸过程中实时拿出爆盖离心管，排气后，再放回，振荡摇匀）。取上清液，即所需要的目的基因。

表1 引物碱基序列Table 1 Primer base sequence

PCR 扩增目的基因：取一个干净的小离心管，依次加入17 μL H2O，0.5 μL Mg2+，1 μL 基因模板，2 μL dNTP，2 μL Buffer，0.5 μL Taq 酶，1 μL 27F，1 μL 1492R，放入PCR 仪中反应，设置程序（见表2）。制作胶体，取0.4 g 琼脂糖，加25 mL EDTA 缓冲液，再加入0.9 mL EB 溴乙锭液体，放置15 min 胶体便制好，加样跑胶，上机marker 跑胶出图[10-15]。

表2 PCR 程序Table 2 PCR program

MEGA 5 构建系统发育树：

1）准备序列文件 准备txt.格式序列文件。

2）多序列比对 开启MEGA 5 系统，单击Align→Edit/Build Alignment→Create a new alignment，点击OK，选择序列为核酸DNA。选好之后，单击Edit→Insert Sequence From File，选择需要的序列文件，点击按钮→Align DNA，在弹出的窗口中，选择默许的比对参数，点OK，进行序列比对，删除两端没有比对上的序列，并保存文件。

3）构建系统进化树 在多序列比对窗口中，点击Data→Phylogenetic Analysis，所用序列是否编码蛋白质，选Yes。返回MEGA 5 主界面，点击Phylogeny →Construct/Test Neighbor-Joining Tree…弹出的对话框：使用当前的数据，选Yes，Bootstrap 为1 000，点击Compute。建树完成后，注意点击Bootstrap consensus tree 查看树形。保存文件为filename.mts（可以用MEGA 5 打开）[16-24]。

1.3.6 细菌耐热性分析 将细菌悬液 （2.2×1010CFU/mL，6×109个）平均分成6 份，分别置于20，40，60，80，100，120 ℃的温度下处理5 min 和10 min，然后分别接种至营养琼脂培养基中进行培养（37 ℃恒温培养48 h）并计数，每组3 个平行，统计菌落数。

1.3.7 数据分析 采用ClustalX 2 对菌株Y8 及模式菌株序列进行比对，MEGA5.2 构建系统发育树。采用Excel 软件作图，结果由3 个平行样的平均值±标准偏差表示。

2 结果与分析

2.1 细菌菌株的形态学初步鉴定

从营养琼脂培养基中挑取分离纯化的菌株，利用光学显微镜观察其颜色、形态特征（见图1），并对比《伯杰细菌鉴定手册》，然后进行形态学鉴定分析。

根据对两种细菌菌落形态及革兰氏染色观察，发现两种菌株均呈短细杆状，表面较粗糙扁平湿润，半透明乳白色，且革兰氏染色为蓝紫色阳性。

2.2 细菌菌株的生理生化鉴定

对菌株进行糖发酵试验，结果如下。

菌株A1 和A2 的糖发酵试验结果见表3。乙酰甲基甲醇V-P 试验呈现红色，判定其为阳性菌。甲基红（Methyl Red）试验呈鲜红色，判定其为阳性菌。靛基质吲哚试验有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，确定为吲哚试验阳性反应。

2.3 对细菌的16SrDNA 序列基因片段的扩增

本试验以1492R 和27F 作为引物，来进行PCR 扩增目的基因，得到的DNA 片段，经过琼脂糖凝胶电泳试验，可以看到一条长度为1 100 bp左右的扩增条带，PCR 基因扩增图（见图2）。

图1 菌株的菌落形态及菌体形态（×40）Fig.1 Colony and thallus morphology of the strain（×40）

表3 菌株的糖发酵试验Table 3 Strain sugar fermentation experiment

结果表明：菌株A2 没有扩增成功，舍去。菌株A1 的16SrDNA 基因片段扩增成功，可以将其送到北京鼎国盛世有限公司直接测序。

2.4 测序结果的BLAST 比对

双向测序结果如表4所示，将公司测序所得到的DNA 序列，输入NCBI 的数据库中，进行BLAST 比对，发现其与地衣芽孢杆菌中的Bacillus licheniformis ZF23 序列的相似度为98%，确定菌株A1 为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。

序列比对分值为1 871 bits，因为分数值越高说明相似度越高；Expect 的期望值为0.0，说明比对效果很好；query cover 同源百分比为98%，Max ident 百分比为97%。确定菌株A1 为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。

图2 菌株A1 的16SrDNA 扩增片段凝胶电泳图Fig.2 The 16SrDNA amplifying fragment gel electrophoresis diagram of the strain A1

表4 菌株A1 的16SrDNA 序列的测序片段Table 4 Sequence of 16SrDNA sequences of strain A1

（续表4）

2.5 基于16SrDNA 序列分析的菌株系统发育树构建及分子鉴定

根据序列BLAST 比对结果，选择同源性较高的菌株，建立系统进化树，分析菌株的种属地位。构建的系统发育树如图3所示。由图3可以看出菌株A1 与地衣芽孢杆菌的亲缘关系，菌株A1 与菌株Bacillus licheniformis strain ZF23 发育距离相近，其中bootstrap 值为99，可见菌株A1 与其同源性较高，确定其为地衣芽孢杆菌菌种。

2.6 菌株A1 的耐热性分析

由图4、图5可以看到菌株A1 对于高温具有一定的耐受性，在加热温度低于40 ℃时活菌体数量基本没有影响，但随着加热温度的继续升高其耐受力下降，当加热温度高于100 ℃时，加热5 min 和加热10 min 菌体个数基本都趋于0，菌体失活。结果表明本研究从渤海虾酱中分离的菌株A1耐热性不强，80 ℃以上加热熟制后，菌体基本失活，其助消化能力急剧降低。

图3 菌株A1 的16SrDNA 序列系统发育树分析Fig.3 16SrDNA sequence analysis of strain A1 analysis of the neighbor-joining tree

图4 菌株A1 加热5 min 的菌体个数变化Fig.4 The changes of bacteria strains A1 after heating 5 min

图5 菌株A1 加热10 min 的菌体个数变化Fig.5 The changes of bacteria strains A1 after heating 10 min

3 结论

以渤海虾酱为研究对象，通过营养琼脂培养基对虾酱中细菌进行分离纯化镜检，采用PCR 技术提取目的基因，并测序进行BLAST 比对，建立系统发育树，得到1 株细菌A1，与地衣芽孢杆菌中的Bacillus licheniformis strain ZF23 的同源相似度为98%，其中bootstrap 值为99。对该菌株进行耐热性分析，发现地衣芽孢杆菌对于高温耐受性较差，随着加热时间和温度的增加其存活率逐渐下降，结果表明虾酱在实际应用过程中80 ℃及以上的加热处理将致使其助消化能力显著降低。本研究为虾酱在食品加工过程中的合理利用提供一定的理论依据。