赣南脐橙代谢组学研究

祝爱艳 梁 露 侯金雪 孙雪枫 杨延峰 王远兴

（南昌大学食品科学与技术国家重点实验室 南昌330047）

赣南脐橙是指产于江西赣州的脐橙。近几年来，赣南已成为全世界种植面积最大，年产量世界第三、全国第一的脐橙产区[1]。赣南脐橙因色泽鲜艳、风味浓甜芳香、口感酸甜适度而深受广大消费者的欢迎和喜爱[2]。代谢组学是系统生物学中继基因组学、转录组学和蛋白质组学后又一重要分支，是研究生物体受病理生理刺激或基因改变而引起的体内代谢物动态变化的一门新学科[3]。核磁共振（NMR）技术、液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术、气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术等常用于代谢组学研究[4-8]，并通过化学计量学分析、主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘分析（OPLS-DA）进行数据分析。代谢组学已被应用医学、植物和微生物等领域[9-14]。目前国内代谢物组学的研究大多为代谢指纹图谱（metabolite fingerprinting），代谢指纹图谱是对所有代谢物进行高通量的代谢分析，是一种非靶点的方法。非靶点[15]代谢组学全面检测生物体整个代谢，重点寻找不同环境下植物样品中有显著变化的代谢特征，并鉴定代谢特征的化学结构，进而解释所发现的代谢物及其代谢通路与生命过程或生命状态之间的关联。Parastar H 等[16]采集了4 种柑桔属植物（柠檬、橙、柑桔、葡萄柚）的18 个批次样本，并采用多种化学计量学方法对其果实皮的次级代谢产物进行GC-MS 指纹性分析，结果表明代谢组学方法可以用于柑桔类植物的辨别。Díaz R 等[17]利用超高效液相-四级杆-飞行时间串联质谱对柑橘产地溯源进行研究，结果表明，通过多元统计学分析得到重要的标志物为枸橼苦素D，可以区分瓦伦西亚和其它外国的柑橘。

目前，有关赣南脐橙挥发性成分有一定的报道[18-19]，主要是脐橙果皮、果肉中挥发性风味物质，未见对其产地溯源的分析报道。唐会周等[20]采购市售5 种脐橙，利用其挥发性成分进行主成分分析，结果表明，不同脐橙的香气成分有所差异。该研究未对其影响差异的成分进行分析。近年来，我国的脐橙栽培面积不断扩大，市场上赣南脐橙因受到其它产区的伪冒果品的影响，使消费者对其质量和信心大大降低，建立相关的评价方法鉴别真伪可保证赣南脐橙的品质并提高其市场竞争力。

本试验中采用GC-MS 分析脐橙的挥发性物质，通过代谢组学分析方法比较赣南脐橙和其它地区脐橙的差异性，找寻脐橙的潜在生物标志物，区分赣南脐橙和其它地区的脐橙，以期完善赣南脐橙质量评价体系，树立赣南脐橙的品牌。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

赣南脐橙采摘于赣南信丰、寻乌、安远和瑞金等地，非赣南脐橙采摘于新宁、秭归等地。所有赣南脐橙和非赣南脐橙均新鲜无病虫害，每个地区在不同地方采集6 个点，试样均采于同年同月。每组样品选取6 个大小均匀、无损伤的去皮去核脐橙，将其可食部分打碎混匀，用于试验分析。

1.2 仪器与设备

AL 104 电子天平，瑞士Mettler Toledo 公司；7890-7000GC-QQQ-MS 气相色谱-三重串联四极杆质谱联用仪（配有MassHunter Workstation 色谱工作站和NIST MS Search 2.0 质谱检索数据库），美国Agilent 公司；DKS-24 不锈钢新型电热恒温水浴锅，嘉兴市中新医疗仪器有限公司；料理机，九阳有限公司；57330-U SPME 手柄，美国SUPELCO 公司；50/30 μm 二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS，Stable flex）固相微萃取纤维头，美国SUPELCO 公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理 分别精确称取3.00 g 赣南脐橙和非赣南脐橙果肉匀浆于20 mL 顶空萃取瓶中，立即用聚四氟乙烯隔垫盖子密封；将顶空萃取瓶置于50 ℃水浴锅中水浴平衡30 min；再将固相萃取头插入顶空萃取瓶中，萃取吸附30 min。萃取后将萃取头放入GC-MS 进样口中，250 ℃解析5 min。

1.3.2 色谱条件 色谱柱：HP-5 MS 毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升温：起始柱温35℃，保持5 min，以6 ℃/min 升至60 ℃，保持1 min，然后以3 ℃/min 升至140 ℃，保持1 min；再以7 ℃/min 升至240 ℃，保持3 min；载气：高纯氦气 （纯度≥99.999%）；流速1 mL/min；进样量1 μL；进样口温度250 ℃；分流比5∶1。

1.3.3 质谱条件 电子电离 （electron ionization，EI）源；电子能量：70 eV；离子源温度为230 ℃；电子倍增管电压350 V 溶剂延迟3 min；质量扫描为全扫描方式，扫描范围m/z 50～450。

1.4 数据分析

样品利用GC-MS 进行检测，得到样品的总离子流图（Total ion current，TIC），根据其总离子流图的保留时间和质荷比进行峰的匹配，并采用峰面积归一化法计算各个样品挥发性成分的相对百分含量，得到原始数据矩阵。脐橙中的挥发性成分利用NIST MS Search 2.0 质谱图库检索，结合匹配分值和相关的文献确定各色谱峰对应的化学成分，对其进行初步筛查鉴定。将得到的原始数据矩阵导入SIMCA-P 13.0 软件（Umetrics，瑞典）进行多维统计学分析。利用非监督性的主成分分析（Principle Component Analysis，PCA）进行降维和对整体的分布趋势进行预览，采用有监督性的正交偏最小二乘法判别分析 （Orthogonal partial Least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）对其进行建模。根据分析结果结合spss 进行t 检验，筛选潜在生物标志物。

2 结果与分析

2.1 GC-MS 总离子流图分析

按照上述方法依次测定各个脐橙样本的挥发性成分，总离子流图见图1，图1中非赣南脐橙挥发性成分总离子流图在上方，下面为赣南脐橙的挥发性成分总离子流图。由图1可以看出，该方法所得谱图的色谱峰分离度和丰度良好，且出峰较多；赣南脐橙与非赣南脐橙的挥发性成分峰形有较为明显的差异，表明挥发性成分在脐橙中含量有所差异。

图1 赣南脐橙和非赣南脐橙的挥发性成分的总离子流色谱图Fig.1 Total ion current chromatograms of volatile components in Gannan navel orange and non Gannan navel orange

根据气相色谱-三重串联四极杆质谱联用仪配有的NIST MS Search 2.0 质谱检索数据库检索结果进行匹配，并结合保留时间、特征离子、相对丰度以及相关文献对赣南脐橙的挥发性成分进行了鉴定，鉴定结果见表1。由表1可知，赣南脐橙样品中共鉴定出66 种物质，包括萜烯类、醛类、醇类、酯类、酮类等，其中含量最高的为D-柠檬烯。孙莹等[18]对不同成熟度赣南“纽荷尔”脐橙通过GC-MS 对其香气成分进行采集，经过数据库匹配并结合文献等相关分析，赣南脐橙中共检测出68 中香气成分，且D-柠檬烯含量最高。上述研究鉴定出的挥发性成分较本试验挥发性物质多，这可能是由于赣南脐橙保存方法和生长环境等不同的原因造成的。结合相关报道[18-20]的文献可得，对脐橙检测的挥发性成分及含量稍有不同，但D-柠檬烯含量均最高。D-柠檬烯是大多数柑橘类果实的最主要香气成分。

表1 赣南脐橙挥发性成分的定性分析结果Table 1 Qualitative analysis of volatile components in Gannan navel orange

2.2 模型的构建和验证

试验中首先将预处理的GC-MS 数据进行非监督PCA 分析，获得各地脐橙样本在空间上的分布情况，如图2a 所示。由图2a 可知，赣南脐橙和非赣南脐橙有明显分离，相同产地的脐橙之间距离很近，表明PCA 分析对赣南脐橙和非赣南脐橙的产地有较好的区分效果，说明不同产地的脐橙的挥发性成分含量有区别。监督性OPLS-DA 分析可以剔除与样品分组无关的因素，排除样本之间的误差及其它的随机误差，并使组间的差异得到最大化。因此采用OPLS-DA 分析，如图2b 所示。由图2b 可知，赣南脐橙和非赣南脐橙完全分开。模型的评价指标R2Ycum=0.985，Q2cum=0.71，说明所建模型良好。为了进一步验证模型是否过拟合，采用200 次响应的置换检验，结果见图3。图3中R2代表Y 变量的可解释性，Q2代表模型的可预测性，由图3可知，Q2于Y 轴的截距是负值，且置换检验得到的R2Ycun=0.939 和Q2cum=－0.269 均小于原始值，由此可得此模型没有过拟合。

2.3 潜在标志物的筛选和鉴定

s-plot 图能同时体现每个变量与模型某一成分之间的协变性和相关性，并可以用于鉴别具有生化意义的变量，因为它们分别代表变量在模型的贡献大小和变量的权重系数。s-plot 图中位于两端的变量在模型的贡献率越大，由此可用s-plot观察和选择差异性变量[17，21]。变量权重重要性排序（the variable importance in the projection，VIP）值可以评价变量的贡献大小，通常选用VIP＞1 的变量[21-23]。在此基础上，需用学生氏t 检验的P 值（阈值0.05）来验证变量是否具有统计学意义。

图2 GC-MS 分析脐橙样本的PCA 图（a）和OPLS-DA 图（b）Fig.2 PCA score plot （a）and OPLS-DA score plot （b）of GC-MS data from navel orange

图3 OPLS-DA 模型的置换检验Fig.3 Permutation test of OPLS-DA model

图4 GC-MS 分析脐橙样本的s-plot 图Fig.4 s-plot of GC-MS data from navel orange

通过选用VIP＞1 并结合s-plot 图筛选影响脐橙产地差异的显著指标，如图4所示，红色标识为所筛选的差异显著的24 种物质。对于筛选的24种物质进行t 检验，验证这些变量在两组之间是否含有统计学差异，并排除P＞0.05 的变量。结合上述筛选最终有5 种物质符合要求，见表2，分别为（1S）-（+）-3-蒈烯、4-蒈烯、壬醛、（Z）-石竹烯、桉烷-3，7（11）-二烯，这些物质可作为区分赣南脐橙和非赣南脐橙的潜在标志物。

表2 基于GC-MS 的赣南脐橙与非赣南脐橙的潜在生物标志物Table 2 Potential biomarkers of Gannan navel orange and non Gannan navel orange based on GC-MS

3 结论

本试验通过GC-MS 分析赣南脐橙和其它地区脐橙中的挥发性物质，利用NIST MS Search 2.0 质谱图库检索并结合相关文献，初步鉴定其挥发性物质。脐橙中共检测出66 种物质，分别为萜烯类、醛类、醇类、酯类、酮类等，其中D-柠檬烯含量最高。并通过建立脐橙的OPLS-DA 模型，发现5 种物质可作为区分赣南和其它地区脐橙的潜在生物标志物。这5 种物质分别为（1S）-（+）-3-蒈烯、4-蒈烯、壬醛、（Z）-石竹烯、桉烷-3，7（11）-二烯。这可进一步保障市场上赣南脐橙的品质，以谨防假冒伪劣。在今后的研究中，可扩大采样范围，并对潜在生物标志物进行系统性和深入性研究，使其结果更具有实用价值。