海南传统发酵蔬菜中微生物多样性分析

谷懿寰 彭倩楠 姜帅铭 马臣臣 霍冬雪

（海南大学食品学院 海口570228）

发酵蔬菜是以新鲜蔬菜为原料，经微生物发酵形成的传统风味食品[1]，其风味物质主要通过蔬菜原辅料、微生物发酵、生理生化和酶促反应3 个途径形成[2-3]。我国发酵蔬菜主要采用自然发酵方式，借助天然附着于蔬菜表面的多种微生物进行腌制[4-5]，其中起主导作用的是乳酸菌群，是形成发酵蔬菜独特风味的主要微生物，发酵的产品具有酸咸味正、微辣微甜、醇香可口的独特风味[6]。研究表明发酵蔬菜具有净肠、预防肠炎、抗动脉硬化、抗老化和抗癌等多种功能[7-8]。近年来，国内外学者对多种传统发酵蔬菜中的微生物多样性进行了研究。王磊等[9]对东北家庭自制酸菜进行研究，经16S r DNA 序列分析鉴定出40 种乳酸菌，主要为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、混淆魏斯氏菌（Weissella confuse）、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、食物魏斯氏菌（Weissella cibaria）。李雪萍[10]对采集自甘肃省庆阳市环县的西北地区传统发酵蔬菜浆水进行研究，确定乳杆菌为其发酵过程中主要菌属之一。田伟[11]通过16S rRNA 基因序列分析，确定四川传统泡菜样品中戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）、植物乳杆菌和有害片球菌（Pediococcus damnosus）是优势菌种。侯强川等[12]通过纯培养的方法结合16S rRNA 测序技术对采集自俄罗斯卡尔梅克共和国埃利斯塔市郊的2 份发酵蔬菜样品中的乳酸菌进行分离鉴定，结果表明乳杆菌和乳球菌（Lactococcus）是其中的优势菌属。Chao 等[13]从台湾客家部落传统酸菜和福菜中分离得到的微生物属于肠球菌、乳杆菌、明串珠菌、片球菌和魏斯氏菌（Weissella）。Myungjin 等[14]采用16S rRNA 基因克隆文库的方法对5 种韩国泡菜的微生物群落结构进行分析，发现其中大部分属于乳酸菌。

海南省地理位置独特，气候条件优越，拥有丰富的微生物资源，是我国发展热带生物产业和研究热带微生物资源的重要区域[15]。海南发酵蔬菜以家庭式天然发酵为主，保留了许多当地自然环境中的有益微生物，是研究海南微生物多样性的极佳模型。本研究结合纯培养技术和16S rRNA基因序列分析，对采自海南省不同地区的发酵蔬菜样品进行微生物多样性分析，旨在发掘海南地区的热带微生物资源，并为其开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 从海南白沙、昌江、临高、琼中、文昌、万宁和五指山7 个地区采集的30 份家庭自制发酵蔬菜样品，种类包括竹笋、小西瓜、白菜和豆角。

1.1.2 主要试剂 MRS 培养基，北京陆桥技术有限责任公司；M17 培养基，英国OXOID 公司；6×DNA loading buffer，2×Es Taq Master Mix，D2000 DNA ladder，蛋白酶K，均购于北京康为世纪生物科技有限公司；SYBR Green 2×Buffer，宝生物工程（大连）有限公司；Goldview，美国AMERCO 公司；Agarose LE，天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.3 设备与仪器 SW-CJ-2F 型双人双面净化工作台，苏州净化设备有限公司；HH-4 数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；生化培养箱，电热鼓风干燥器，上海一恒科学仪器有限公司；PCR扩增仪，杭州朗基科学仪器有限公司；85-1 恒温磁力搅拌器，常州澳华仪器有限公司；台式冷冻离心机，SORVALL；荧光定量PCR 仪，Bio-Red 公司。

1.2 方法

1.2.1 样品采集与处理 发酵蔬菜的种类及采集地见表1。

将发酵蔬菜样品编号，装入无菌采样器，在全程4 ℃低温条件下运输至实验室。每份发酵蔬菜样品各称取10 g 与90 mL 无菌生理盐水混合均匀，10 倍梯度稀释，制成10-1～10-5的稀释液。

表1 发酵蔬菜样品的种类及采集地Table 1 Types and collecting sites of fermented vegetable samples

1.2.2 微生物分离与纯化 从稀释倍数为10-3～10-5的稀释液中各吸取100 μL，涂布于M17 和MRS 琼脂培养基上，每个稀释度涂布1 个平板。置于无氧条件37 ℃恒温培养48 h 后观察菌落形态并记录，挑选疑似菌落接种到肉汤培养基，37 ℃恒温培养48 h。培养完成后，革兰氏染色法在光学显微镜下观察菌体形态，检验是否为纯种。检验为纯种的菌株，传代后用含有0.1%谷氨酸钠的10%脱脂乳于-80 ℃条件下保藏。

1.2.3 16 S rRNA 基因序列分析 液氮冻融法提取菌株总基因组DNA，参考文献[16-18]中的CTAB 法并做修改，DNA 于-20 ℃保存，琼脂糖凝胶电泳检测其纯度。16S rRNA 扩增引物：正向通用 引 物A27F （5′-AGCGGATCACTTCACACAG GACTACGGCTACCTTGTTACG-3′）和反向通用引物A1495R （5′-GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAA GAGTTTGATCCTGGCTCA-3′）。PCR 扩增反应体系：2×Es Taq Master Mix 25 μL，引物（10 pmol/μL）各1.5 μL，DNA 模板（100 ng/μL）1.5 μL，ddH2O 补足至50 μL。反应参数：预变性94 ℃，5 min；变性94 ℃，1 min；退火55 ℃，1 min；延伸72℃，2 min，循环30 次；72 ℃末端延伸10 min，4 ℃保温。

PCR 产物用琼脂糖凝胶电泳检测，条带清晰且无明显非特异性扩增即PCR 成功。测序工作由上海派诺森生物科技有限公司完成。

1.2.4 qPCR 分析 采用液氮冻融法提取发酵蔬菜中微生物宏基因组DNA，结合分离鉴定结果并参照文献[19]合成乳杆菌、片球菌和肠球菌属特异性引物，qPCR 引物见表2，通过扩增上述菌属的对照菌株构建标准曲线，将标准菌株稀释后与样品一起进行qPCR 并计算样品中目的菌属的基因拷贝数。qPCR 反应体系：SYBR Green 2×Buffer 10 μL（10 μmol/L），DNA 模板2 μL，引物各1 μL，ddH2O 补足至20 μL，3 个重复。反应参数：94 ℃30 s；94 ℃5 s；在其各自的退火温度下退火40 s；72 ℃50 s，循环40 次。熔融曲线温度65～95 ℃。qPCR 工作由上海派诺森生物科技有限公司完成。

表2 qPCR 引物Table 2 Primers for qPCR

2 结果与分析

2.1 微生物分离与纯化

经分离纯化从样品中分离出172 株菌株。

2.2 16S rRNA 序列同源分析鉴定

使用SeqMan 对测序结果进行拼接，手动修正错误，序列约长1 500 bp。利用NCBI 数据库BLAST 分析，选择准确率和覆盖率在98%及以上的作为鉴定结果。16S rRNA 基因序列同源分析共鉴定出乳杆菌（145 株）、肠球菌（26 株）、片球菌（1株）三大类菌属，其中乳杆菌属数量最多，占菌属总数的84.30%。在白沙、昌江、临高、琼中、文昌和五指山6 个地区的样品中均发现大量植物乳杆菌（65 株），可见植物乳杆菌是海南发酵蔬菜中的优势菌种。另外还鉴定出其它12 种乳杆菌，酸面团乳杆菌（Lactobacillus zymae）1 株、葡萄酒乳杆菌（Lactobacillus vini）2 株、青贮饲料乳杆菌（Lactobacillus silagei）2 株、深圳乳杆菌（Lactobacillus shenzhenensis）2 株、戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）2 株、面包乳杆菌（Lactobacillus panis）2株、那慕尔乳杆菌（Lactobacillus namurensis）6 株、纳格尔氏乳杆菌（Lactobacillus nagelii）1 株、福菜乳杆菌 （Lactobacillus futsaii）1 株、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）54 株、棒状乳杆菌（Lactobacillus coryniformis）1 株、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）6 株。肠球菌属占总体的15.12%，鉴定出两类菌种，屎肠球菌（Enterococcus faecium）24株和粪肠球菌（Enterococcus faecalis）2 株。研究还发现少量的戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）1 株。

2.3 不同地区发酵蔬菜微生物多样性对比

由表3可看出，7 个地区的发酵蔬菜样品在菌种种类和数量上存在一定差异。由图1可更直观看出生物多样性的差异。

表3 不同地区发酵蔬菜样品16S rRNA 序列同源分析鉴定结果Table 3 Identification of isolates based on 16S rRNA sequencing of fermented vegetable samples from different regions

（续表3）

图1 不同地区发酵蔬菜微生物多样性对比Fig.1 Comparison of microbial diversity in fermented vegetables from different areas

五指山地区样品中分离鉴定出的微生物种类最多，共6 个菌种，31 株菌，占总数的18.02%。琼中地区样品中分离鉴定出的微生物数量最多，共38 株菌，占总数的22.09%，属5 个菌种。文昌地区样品中分离鉴定出的微生物种类和数量均最少，共4 个菌种，7 株菌，占总数的4.07%。

琼中地区特有的菌种为戊糖片球菌。文昌地区特有3 个菌种分别为酸面团乳杆菌、葡萄酒乳杆菌、纳格尔氏乳杆菌。万宁地区特有的2 个菌种分别为福菜乳杆菌、粪肠球菌。五指山地区特有的3 个菌种分别为青贮饲料乳杆菌、深圳乳杆菌、棒状乳杆菌。

2.4 不同种类发酵蔬菜微生物多样性对比

由表4可知，4 种蔬菜种类的发酵蔬菜样品在菌种种类和数量上存在一定差异，由图2可直接观看出不同蔬菜种类微生物多样性的差异。

发酵豆角样品中菌株数量最多，共分离鉴定出56 株菌，9 个菌种，占总数的32.65%。发酵白菜样品中分离鉴定出的微生物种类最多，但从中分离鉴定出的微生物数量最少，共11 个菌种，29 株菌，占总数的16.86%。发酵小西瓜样品中分离鉴定出的微生物种类最少，共4 个菌种，40 株菌，占总数的23.26%。

在发酵竹笋、发酵小西瓜、发酵豆角、发酵白菜样品中均发现植物乳杆菌、发酵乳杆菌、短乳杆菌、屎肠球菌。发酵豆角中特有的5 个菌种为青贮饲料乳杆菌、深圳乳杆菌、棒状乳杆菌、福菜乳杆菌、戊糖片球菌。发酵白菜中特有的5 个菌种为酸面团乳杆菌、葡萄酒乳杆菌、那慕尔乳杆菌、纳格尔氏乳杆菌、粪肠球菌。

表4 不同种类发酵蔬菜样品16S rRNA 序列同源分析鉴定结果Table 4 16S rRNA sequence homology analysis results of different kinds of fermented vegetable samples

图2 不同种类发酵蔬菜微生物多样性对比Fig.2 Comparison of microbial diversity in fermented vegetables from different kinds

2.5 qPCR 定量优势微生物

基于菌属特异性引物，通过实时荧光定量PCR 技术，对发酵蔬菜中的优势微生物进行定量研究。因测定均为单基因拷贝数，故可代表其含量。各个发酵蔬菜样品中乳杆菌属、片球菌属、肠球菌属的含量如表5所示。

表5 各菌属含量Table 5 Content of bacteria

研究结果表明在每份海南发酵蔬菜样品中乳杆菌的平均含量5.22×107CFU/g，片球菌的平均含量为9.42×105CFU/g，肠球菌的平均含量为1.07×104CFU/g。由表5可知，在白沙、昌江、临高、琼中、文昌、万宁、五指山7 个地区的发酵蔬菜样品中乳杆菌含量均为最高，肠球菌的含量均为最低，且各地区的乳杆菌的含量均明显高于片球菌和肠球菌的含量。在不同的发酵蔬菜样品中乳杆菌含量均为最高，肠球菌的含量均为最低，且乳杆菌含量均明显高于片球菌的含量和肠球菌的含量。

由表6可知，琼中地区的样品中乳杆菌的平均含量最多，白沙地区的样品中乳杆菌的平均含量最少。昌江地区的样品中片球菌的平均含量最多，临高地区的样品中片球菌的平均含量最少。白沙地区的样品中肠球菌的平均含量最多，昌江地区样品中肠球菌的平均含量最少。

表6 不同地区样品中菌属的平均含量Table 6 The average content of bacteria in different areas

由表7可知，发酵豆角中乳杆菌的平均含量最多，发酵小西瓜中乳杆菌的平均含量最少。发酵竹笋中片球菌的平均含量最多，发酵白菜中片球菌的平均含量最少。发酵豆角中肠球菌的平均含量最多，略高于发酵竹笋，发酵白菜中肠球菌的平均含量最少。

表7 不同种类样品中菌属平均含量Table 7 The average content of bacteria in different kinds of samples

3 讨论

本研究通过传统分离培养方法、16S rRNA 基因序列分析和荧光定量PCR 技术对样品中的微生物进行多样性分析。通过分离鉴定，共获得了172 株乳酸菌，其中乳杆菌属是海南发酵蔬菜中的优势菌属，植物乳杆菌是海南发酵蔬菜中的优势菌种。根据丛敏等[20]对以白菜为主要原料的东北酸菜的研究，植物乳杆菌为其发酵中后期的优势菌种；根据陈功等[21]对四川泡菜的研究，植物乳杆菌是其发酵优势菌种之一，本研究结果与之前的结果相符。

本研究发现，不同地区采集的发酵蔬菜中微生物多样性存在差异，采集自五指山地区的发酵蔬菜微生物多样性最为丰富；不同种类的发酵蔬菜中微生物多样性也存在差异，发酵白菜中微生物多样性最为丰富。根据之前的研究[22-24]，发酵食品中微生物的数量与种类与其发酵条件有密切关系。本研究所采集的发酵蔬菜，其自然环境存在差异，原料种类不同，制作方法保留当地特点，发酵的周期、温度、酸度等因素都可能导致从不同发酵蔬菜样品中分离鉴定出的微生物种类及优势菌群不同。

本研究结果揭示了海南传统发酵蔬菜中微生物的多样性，分离并保存了有益菌株，如植物乳杆菌，研究表明其具有降低血清中胆固醇浓度、抑制肠道病原菌增殖、降低食品中亚硝酸盐浓度等益生作用[25]，为后续海南地区有益微生物的开发利用和发酵蔬菜的工业化生产打下基础。